Un test di microneutralizzazione per misurare i titoli anticorpali neutralizzanti nel siero umano

Per un test di microneutralizzazione, prelevare una piastra multipozzetto contenente siero umano inattivato termicamente, diluito in serie con concentrazioni decrescenti di anticorpi neutralizzanti specifici per l'influenza.

Introdurre virus influenzali patogeni. Gli anticorpi sierici interagiscono con i virus e li neutralizzano; Tuttavia, diluizioni sieriche più elevate mostrano una neutralizzazione limitata del virus.

Seme con cellule di rene canino Madine-Darby, o cellule MDCK, che sovraesprimono residui di acido sialico umano sulla loro superficie.

Nella diluizione più elevata, i virus influenzali non neutralizzati si fondono con l'acido sialico delle cellule, rilasciando il genoma virale nel citoplasma cellulare.

I geni virali vengono trascritti e tradotti in proteine virali e nucleoproteine all'interno della cellula ospite.

Trattare con un'alta concentrazione di acetone per la fissazione e la permeabilizzazione.

Introdurre anticorpi primari che interagiscono con le nucleoproteine virali.

Sovrapposizione con anticorpi secondari coniugati con enzimi che interagiscono con gli anticorpi primari. Lavare e trattare con il substrato dell'enzima, producendo un prodotto colorante.

Quantificare le intensità di colore e tracciarle rispetto alla diluizione del siero; la diluizione del siero più alta, raggiungendo il cinquanta per cento di neutralizzazione del virus, rappresenta il titolo di neutralizzazione.

Il giorno 1 del test MN, scongelare i sieri in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius e rimuoverli immediatamente dopo lo scongelamento. Inattivare a caldo i sieri umani per 30 minuti in un bagno d'acqua a 56 gradi Celsius, come descritto nel protocollo di testo. Quindi, mettere i sieri sul ghiaccio e aggiungere il diluente virale ai sieri per ottenere una pre-diluizione da 1 a 10.

Per eseguire il test con un virus, aggiungere 50 microlitri di diluente virale alle righe da B a H, ad eccezione delle colonne 11 e 12. Quindi, aggiungere 100 microlitri di 1 di 10 sieri diluiti alle colonne da A1 a A10. Eseguire una doppia diluizione seriale dalle file A a H e scartare gli ultimi 50 microlitri alla fila H.

Per il controllo del virus, aggiungere 50 microlitri di diluente virale ai pozzetti A12, B12, C12 e D12. Per il controllo cellulare, aggiungere 100 microlitri di diluente virale ai pozzetti E12, F12, G12 e H12. Per i sieri di controllo, aggiungere 100 microlitri di sieri di controllo diluiti al pozzetto A, colonna 11, e aggiungere 50 microlitri di diluente virale ai pozzetti da B11 a H11. Procedere alla diluizione seriale. Coprire le piastre e incubare a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica, fino al momento dell'aggiunta del virus.

Per l'aggiunta del virus, diluire il virus a 100 TCID50 in 50 microlitri con diluente virale. Aggiungere 50 microlitri di virus diluito a tutti i pozzetti, ad eccezione della colonna 11 sulle piastre di titolazione posteriore e dei pozzetti di controllo cellulare E12, F12, G12 e H12 su tutte le piastre. Aggiungere 50 microlitri di diluente virale a tutti i pozzetti della colonna 11. Quindi, aggiungere 50 microlitri del virus a 100 TCID50 in 50 microlitri al primo pozzetto.

Successivamente, miscelare e trasferire 50 microlitri in pozzetti successivi per eseguire due diluizioni seriali. Sostituire i puntali delle pipette tra i pozzetti per evitare il trasferimento del virus. Scartare 50 microlitri dal pozzetto H11, quindi aggiungere 50 microlitri di diluente virale alla colonna 11 per portare il volume finale a 100 microlitri. Tocca i piatti per mescolare. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per un'ora prima di eseguire l'aggiunta di cellule MDCK il primo giorno e l'ELISA il secondo giorno come prima.

Dopo aver aggiunto gli anticorpi primari e secondari, come descritto nel protocollo di testo, eseguire l'aggiunta del substrato e la lettura della piastra. Lavare le piastre cinque volte con 300 microlitri di tampone di lavaggio e picchiettare su un panno privo di lanugine. Aggiungere 100 microlitri di substrato OPD appena preparato a ciascun pozzetto. Quindi, incubare le piastre a temperatura ambiente fino a quando i pozzetti di controllo del virus raggiungono una densità ottica a 490 nanometri tra 0,8 e 3, con il controllo cellulare a un basso OD di fondo inferiore a 0,2. Quindi, aggiungere 100 microlitri della soluzione di arresto a tutti i pozzetti.

Leggere il diametro esterno dei pozzetti a 490 nanometri, utilizzando uno spettrofotometro per micropiastre. Infine, determinare il titolo di anticorpi neutralizzanti di ciascun campione di siero, come descritto nel protocollo di testo.