Misurazione dell'inibizione immuno-indotta della crescita delle piantine

Trapiantare le piantine in pozzetti contenenti le concentrazioni desiderate di un peptide elicitore immunitario, un frammento proteico derivato da molecole associate a patogeni.

Questo peptide si lega ai recettori di riconoscimento dei modelli, o PRR, sulle cellule vegetali, avviando una cascata di segnalazione.

Questa cascata include la fosforilazione dell'omologo della burst ossidasi respiratoria, o proteine RBOH, che diventano enzimaticamente attive e catalizzano la produzione di specie reattive dell'ossigeno o ROS.

I ROS agiscono come messaggeri secondari nelle vie di segnalazione immunitaria, amplificando la risposta di difesa avviata dai PRR, e funzionano come agenti antimicrobici diretti, inibendo la crescita dei patogeni danneggiando i loro componenti cellulari.

Durante la produzione di ROS, la pianta alloca energia e sostanze nutritive per sostenere la sua risposta immunitaria, distogliendo risorse dai processi legati alla crescita che provocano l'inibizione della crescita.

Determinare la percentuale di inibizione della crescita nelle piantine trattate con elicitore rispetto alle piantine non trattate correlando i loro pesi freschi.

L'aumento delle concentrazioni di elicitori peptidici inibisce la crescita delle piantine a causa dell'aumento delle risposte immunitarie e delle alterazioni biochimiche associate.

A quattro giorni dalla terminazione, caricare ogni pozzetto di una piastra a 48 pozzetti con 500 microlitri di terreno MS integrato con una diluizione del peptide dell'elicitore. Successivamente, utilizzare una pinza sterile per trapiantare con cura da sei a otto piantine della stessa dimensione, età e genotipo per ogni diluizione del peptide, facendo attenzione che non vi siano danni alla piantina o rotture alla radice e che la radice sia immersa nel terreno.

Quando tutte le piantine sono state placcate, sigilla le piastre con nastro adesivo per micropori e posiziona le piante in condizioni standard di giornata corta per otto-12 giorni. Per determinare la percentuale di inibizione della crescita, scatta una foto per registrare visivamente l'inibizione della crescita prima di rimuovere con cura le piantine da ciascun pozzetto. Quindi, tampona le radici su un tovagliolo di carta per asciugarle e pesa ogni piantina su una bilancia analitica.