JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 3:42 min. • July 8th, 2025
Prelevare una micropiastra contenente segmenti di guaina uniformi tagliati da piantine di riso e dischi fogliari ricavati da foglie di piante di riso.
Aggiungere acqua sterile e incubare durante la notte per consentire il recupero dallo stress della ferita.
Aggiungere un peptide immunogenico derivato da flagelli batterici che agisce come pattern molecolare associato a patogeni o PAMP.
Le cellule vegetali ai bordi tagliati si legano ai PAMP tramite recettori di riconoscimento dei modelli.
Il legame innesca la segnalazione a valle, attivando un enzima localizzato nella membrana plasmatica chiamato omologo della burst ossidasi respiratoria o RBOH.
L'RBOH attivato produce specie reattive dell'ossigeno o ROS nell'apoplasto, lo spazio intercellulare. I ROS prodotti vengono convertiti in perossido di idrogeno.
Aggiungere un enzima perossidasi e un substrato chemiluminescente.
La perossidasi utilizza il perossido di idrogeno per convertire il substrato in uno stato intermedio eccitato, che rilascia energia sotto forma di luce e ritorna allo stato fondamentale.
Misurare la luminescenza in entrambi i tipi di tessuto per rilevare un forte aumento subito dopo il trattamento PAMP, che indica un'esplosione di ROS.
Tagliare la guaina delle piantine di riso di 10 giorni in segmenti di 3 millimetri con una lama di rasoio affilata o una lama chirurgica per il pretrattamento un giorno prima del test ROS. Porre 5 segmenti di guaina in un pozzetto individuale di una piastra per microtitolazione a 96 pozzetti contenente 100 microlitri di acqua bidistillata per 10-12 ore.
Taglia i dischi fogliari da piante di riso di quattro o sei settimane usando un punzone da biopsia con uno stantuffo. Tagliare sempre i dischi delle foglie dal terzo centrale della seconda foglia della fresa principale per ridurre la variazione dei dati. Successivamente, posizionare un disco fogliare in un pozzetto individuale di una piastra per microtitolazione a 96 pozzetti contenente 100 microlitri di acqua a doppia distillazione per 10-12 ore per il pretrattamento. Mantenere tutti i dischi fogliari galleggianti e rivolti verso l'alto nei pozzetti di una piastra di microtitolazione per il pretrattamento dell'acqua per evitare variazioni associate al lato fogliare.
Preparare la soluzione di elicitazione combinando 9,4 ml di tris-HCl 50 micromolari, 400 microlitri di soluzione di L-012, 100 microlitri di perossidasi di rafano e 100 microlitri di flg22. Aggiungere 200 microlitri di soluzione di elicitazione ai pozzetti.
Avvia il software e fai clic sul pulsante Esperimenti per creare un nuovo protocollo o utilizzare un protocollo esistente. Fare clic su Procedura nel pop-up per impostare la piastra e selezionare i pozzetti dalla piastra da monitorare. Fare clic su Avvia cinetica e impostare l'autonomia su 30 minuti o più, a seconda dei requisiti sperimentali. Selezionare l'intervallo minimo per ottenere le letture il più frequentemente possibile e, per il tempo di integrazione, scegliere 1 secondo o più, a seconda dell'intensità del segnale.
Fare clic su Convalida seguito da OK per confermare le impostazioni. Quindi fare clic su Rileva una nuova piastra nel pop-up e attendere che il software visualizzi la finestra di dialogo della piastra di carico. Rimuovere con cura l'acqua bidistillata dai pozzetti contenenti i tessuti pretrattati, evitando danni o disseccamenti ai tessuti. Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 200 microlitri di soluzione di elicitazione ai pozzetti contenenti i tessuti. Posizionare la piastra da testare sul supporto e iniziare il rilevamento.