Misurazione dell'alloreattività in una popolazione mista di cellule T

Inizia con una piastra a più pozzetti contenente cellule dendritiche di topo, o DC che trasportano alloantigeni o varianti genetiche di autoantigeni.

Introdurre le cellule T di topo, comprese le cellule T alloreattive che non sono reattive agli autoantigeni, riconoscendo gli antigeni estranei.

Le cellule T alloreattive riconoscono questi alloantigeni e interagiscono con le DC, innescando il riarrangiamento del citoscheletro, inclusa la riorganizzazione della F-actina.

Questo promuove i recettori sulle cellule T a impegnarsi con le molecole co-stimolatorie sulle DC, formando una connessione cellulare, una sinapsi immunologica.

Fissare le cellule, trasferirle in una provetta e introdurre un cocktail di anticorpi marcati con fluorocromo specifici per le cellule T e i recettori DC, conferendo una fluorescenza distinta.

Rimuovere gli anticorpi non legati e risospendere le cellule in un tampone contenente un agente permeabilizzante che permeabilizza le cellule e marcatori proteici verdi marcati con fluorofori che si legano alla F-actina.

Centrifugare e risospendere le cellule in un tampone contenente colorante nucleare, colorando i nuclei di rosso.

Utilizzando la citometria a flusso di imaging, identificare i doppietti, corrispondenti ai coniugati delle cellule T e DC con mirino verde di F-actina, confermando la formazione delle sinapsi.

Quantifica i doppietti che rappresentano il grado di alloreattività.

Iniziare seminando da 0,5 volte 10 alla sesta cellula dendritica in ciascun pozzetto di una piastra di coltura cellulare a 96 pozzetti, seguita da 1 volta 10 alla sesta cellula T in un volume finale fino a 50 microlitri totali di terreno di coltura per pozzetto. Incubare le colture fredde per quattro ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Quindi, aggiungere tre volte il volume di coltura dell'1,5% di formaldeide in PBS a ciascun pozzetto per 30 minuti a temperatura ambiente. Al termine della fissazione, trasferire le cellule da ciascun pozzetto in una provetta di polistirene da 5 millilitri corrispondente e colorare le cellule con gli appropriati anticorpi coniugati con fluorocromo in 100 microlitri di tampone di lavaggio per 30 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.

Successivamente, lavare le cellule in 1 millilitro di tampone di lavaggio e risospendere i pellet in tampone di lavaggio permanente contenente falloidina-FITC. Dopo altri 30 minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce, lavare le celle in 1 millilitro di tampone di lavaggio permanente fresco. Risospendere i pellet nel colorante nucleare di interesse nel tampone di lavaggio permanente per un'incubazione finale di 30 minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce, e lavare le cellule in 1 millilitro di tampone di lavaggio permanente, seguito da un lavaggio nel solo tampone di lavaggio. Quindi, risospendere le cellule in 50-100 microlitri di tampone di lavaggio fresco e trasferire le cellule in provette da microcentrifuga con tappo piccolo.

Per analizzare le interazioni cellula-cellula, in primo luogo, riservare un canale per l'acquisizione di immagini in campo chiaro e caricare il primo tubo di controllo. Con il canale di campo chiaro disattivato, nella finestra Area di lavoro, creare un nuovo grafico a dispersione per ogni canale utilizzato con le proporzioni sull'area e controllare i singoletti dove le proporzioni sono vicine a uno.

Per ogni fluorocromo, controllare la popolazione positiva e regolare la tensione del laser nella scatola di illuminazione, se necessario. Nella casella Canali, selezionare i canali appropriati per i fluorocromi utilizzati nella colorazione. Quindi, fai clic su Registra. Quando il numero di eventi raggiunge la soglia specificata, l'acquisizione si interromperà automaticamente.

Dopo aver acquisito tutti i controlli a singola colorazione, caricare la prima provetta campione sperimentale e acquisire diverse decine di migliaia di eventi nei canali di analisi appropriati, incluso il canale in campo chiaro.