Un saggio di risazzurina di agar carbone per valutare l'attività del composto di prova contro i micobatteri

Prendi una piastra a più pozzetti contenente micobatteri. Aggiungere concentrazioni crescenti di composti in esame ai pozzetti.

incubare. A seconda dell'azione del composto sui micobatteri, può inibire la crescita dei micobatteri, mostrando un'attività batteriostatica, o eliminare i micobatteri, dimostrando attività battericida.

Trasferire le aliquote dei pozzetti in un saggio di agar resazurina al carbone, o CARA, per micropiastra contenente agar con carbone attivo per assorbire il composto in esame, prevenendo gli effetti del carryover.

incubare. L'attività batteriostatica del composto inibisce la replicazione micobatterica, mentre l'attività battericida riduce la vitalità micobatterica.

Aggiungere tampone, resazurina e un tensioattivo non ionico per disperdere la resazurina nei pozzetti.

Nei micobatteri metabolicamente attivi, le deidrogenasi riducono la resorufina di colore blu, debolmente fluorescente, a una resorufina rosa fluorescente.

Utilizzando un lettore di micropiastre, misurare la fluorescenza della resorufina nei pozzetti.

I pozzetti privi di fluorescenza della resorufina indicano l'attività battericida del composto.

La variazione dell'intensità della fluorescenza tra i pozzetti indica la carica batterica viva, riflettendo la potenza battericida o batteriostatica dipendente dalla concentrazione dei composti in esame.

Inoculare provette da centrifuga in polipropilene a fondo tondo o coniche contenenti rispettivamente 4 o 20 millilitri di Middlebrook 7H9-ADN o 7H9-OADC con M. smegmatis a un OD₅₈₀ da 0,01 a 0,1. Incubare le colture di M. smegmatis a 37 gradi Celsius e 20% di O₂ con agitazione, espandendo le colture alla fase di log medio o a un OD₅₈₀ approssimativo di 0,5.

Per impostare un esperimento di concentrazione inibitoria minima in condizioni di replicazione e non replicazione, distribuire 200 microlitri di cellule in 7H9-ADN a un OD₅₈₀ di 0,01 in tutti i pozzetti di una piastra a 96 pozzetti trattata con coltura tissutale a fondo chiaro.

Per il test non replicante, utilizzare PBS contenente lo 0,02% di tiloxapol per lavare le cellule due volte e utilizzare un terreno non replicante per risospendere le cellule. Utilizzare un terreno non replicante per diluire le cellule a un OD₅₈₀ di 0,1 e aggiungere nitrito di sodio a una concentrazione finale di 0,5-5 millimolari da un ceppo molare appena preparato.

Distribuire 200 microlitri di cellule con un OD₅₈₀ di 0,1 in tutti i pozzetti di una piastra a 96 pozzetti trattata con coltura tissutale a fondo chiaro. Dopo aver preparato gli agenti di test secondo il protocollo di testo, aggiungere 2 microlitri di agente di test #1 nelle file da A a E e 2 microlitri di agente di test #2 nelle file da E a H e mescolare accuratamente.

Per i saggi replicanti, incubare le micropiastre di M. smegmatis a 37 gradi Celsius, 20% O₂ e 5% CO₂ per 1-48 ore. Nei punti temporali in cui il CARA verrà utilizzato come lettura, utilizzare una pipetta multicanale P200 impostata da 50 a 75 microlitri per risospendere con cura il contenuto del pozzetto della piastra del saggio in stile MIC90 pipettando su e giù da 5 a 10 volte. Quindi, utilizzare i puntali della pipetta per far roteare delicatamente il contenuto dei pozzetti con un movimento circolare.

Trasferire 10 microlitri del contenuto del pozzetto del saggio non diluito nei pozzetti corrispondenti della micropiastra CARA, evitando schizzi durante i trasferimenti e assicurandosi che l'aliquota da 10 microlitri sia localizzata al centro dei pozzetti della micropiastra CARA. Con il nastro adesivo, rilegare le pile di micropiastre CARA, quindi inserirle in un sacchetto di plastica richiudibile. Incubare le micropiastre CARA di M. smegmatis a 37 gradi Celsius con il 20% di O₂ per uno o due giorni per le piastre replicanti e per due o tre giorni per le piastre non replicanti.

Quando un film di crescita batterica o colonie macroscopiche più grandi sono visibili nei pozzetti di controllo negativo, utilizzare un singolo set di 12 puntali P200 con una pipetta multicanale per erogare 40 microlitri di PBS sterile lungo il lato dei pozzetti e consentire al PBS di distribuirsi sulla parte superiore delle microcolonie batteriche di agar.

Preparare il reagente di sviluppo CARA mescolando 5 milligrammi di resazurina e 50 millilitri di Tween-80 al 5% in PBS. Aggiungere 50 microlitri di reagente di sviluppo CARA appena preparato a ciascun pozzetto della micropiastra CARA. Quindi, fai oscillare le piastre avanti e indietro un paio di volte per distribuire il reagente sull'agar e sul tappetino batterico in ogni pozzetto. Metti le piastre in un sacchetto di plastica richiudibile e incuba a 37 gradi Celsius per almeno 30 minuti per M. smegmatis.

Prima della lettura della fluorescenza, posizionare le micropiastre CARA in una cappa di biosicurezza per 15 minuti a temperatura ambiente con i coperchi rimossi. Quando si utilizzano gli spettrofotometri BSL3 al di fuori di una cappa di biosicurezza, applicare un adesivo PCR di qualità ottica sulla piastra e utilizzare un tovagliolo di carta morbido per sigillare ermeticamente premendo delicatamente sulla superficie dell'adesivo. Determinare la fluorescenza tramite lettura dall'alto con eccitazione a 530 nanometri ed emissione a 590 nanometri.