JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 4:08 min. • July 8th, 2025
Prendi le provette contenenti macrofagi reporter con il gene per la fosfatasi alcalina embrionale secreta o l'enzima SEAP sotto un promotore inducibile.
In una provetta, introdurre un anticorpo specifico per il recettore Toll-like 2 dei macrofagi o TLR2, neutralizzandone l'attività.
In un altro, aggiungere un inibitore per sopprimere la segnalazione TLR4. Lasciare l'ultimo tubo non trattato.
Prendi un vetrino a camera con uno strato adsorbito di pattern molecolari associati al danno o DAMP, proteine rilasciate durante la necrosi cellulare.
Aggiungere macrofagi trattati e non trattati in pozzetti separati e incubare.
TLR2 e TLR4 su macrofagi non trattati si legano ai DAMP, attivando i fattori di trascrizione nuclear factor-kappa-B, o NF-κB, e la proteina attivatrice-1, o AP-1.
Questi traslocano nel nucleo e si legano al promotore del PAES, sovraregolando la produzione di PAE, che viene secreta extracellulare.
Trasferire il surnatante contenente SEAP in una micropiastra con un substrato cromogenico.
SEAP idrolizza il substrato, producendo un prodotto di colore viola-blu. Misurare l'assorbanza.
La neutralizzazione di TLR2 riduce fortemente la produzione di SEAP, indicando TLR2 come mediatore primario.
Per valutare gli effetti di uno strato proteico adsorbito sull'attività di NF-kB/AP-1 mediata dal recettore toll-like, dopo aver coltivato i macrofagi reporter in una fiaschetta di dimensioni adeguate alla confluenza del 70%, staccare le cellule con un'appropriata soluzione di dissociazione enzimatica come dimostrato.
Risospendere le cellule a una concentrazione di 7,3 x 105 cellule per millilitro nel terreno di saggio e aliquotare le cellule in modo uniforme tra tre provette. Trattare la prima provetta di cellule con un microgrammo per millilitro di inibitore di TLR4 per 60 minuti a temperatura ambiente. Trattare la seconda provetta con 50 microgrammi per millilitro di anticorpo anti-TLR2 per 30 minuti a temperatura ambiente e lasciare la terza provetta a temperatura ambiente senza trattamento.
Mentre le cellule sono in incubazione, aggiungere 200 microlitri di lisato e il 10% di siero fetale bovino a tre pozzetti appiccicosi per condizione. Lasciare che le proteine si adsorbiscano a 37 gradi Celsius per il periodo sperimentale appropriato prima di aspirare le soluzioni proteiche con una nuova pipetta Pasteur per ogni pozzetto e lavare le superfici appiccicose del pozzetto tre volte con 250 microlitri di PBS per pozzetto, per 5 minuti per lavaggio.
Al termine del trattamento con macrofagi reporter, aggiungere 200 microlitri di soluzione cellulare in ogni pozzetto. Aggiungere Pam3CSK4 a una concentrazione finale di 150 nanogrammi per millilitro a due pozzetti come controllo positivo per TLR2, come illustrato nello schema.
Per un controllo positivo al TLR4, aggiungere lipopolisaccaride a una concentrazione finale di 1,5 microgrammi per millilitro a due pozzetti. Dopo 20 ore a 37 gradi Celsius, prelevare 20 microlitri di surnatante da ciascun pozzetto in duplicato in una piastra da 96 pozzetti, inclusi tre pozzetti con 20 microlitri di terreno di analisi per pozzetto e il controllo di fondo.
Quindi, aggiungere 200 microlitri di reagente del saggio reporter SEAP a ciascun pozzetto e coprire la piastra con un sigillo adesivo per un'incubazione di 2 ore e 1/2 a 37 gradi Celsius. Trasferire il resto del surnatante in una provetta da 1,5 millilitri per pozzetto appiccicoso e sedimentare i detriti mediante centrifugazione. Quindi, trasferire i surnatanti in nuove provette da 1,5 millilitri per la conservazione a meno 80 gradi Celsius per l'analisi delle citochine proinfiammatorie a valle mediante ELISA. Al termine dell'incubazione, rimuovere il sigillo adesivo dalla piastra e leggere l'assorbanza su un lettore di piastre a 635 nanometri.