JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 4:08 min. • July 8th, 2025
Prendi le provette contenenti macrofagi reporter con il gene per la fosfatasi alcalina embrionale secreta o l'enzima SEAP sotto un promotore inducibile.
In una provetta, introdurre un anticorpo specifico per il recettore Toll-like 2 dei macrofagi o TLR2, neutralizzandone l'attività.
In un altro, aggiungere un inibitore per sopprimere la segnalazione TLR4. Lasciare l'ultimo tubo non trattato.
Prendi un vetrino a camera con uno strato adsorbito di pattern molecolari associati al danno o DAMP, proteine rilasciate durante la necrosi cellulare.
Aggiungere macrofagi trattati e non trattati in pozzetti separati e incubare.
TLR2 e TLR4 su macrofagi non trattati si legano ai DAMP, attivando i fattori di trascrizione nuclear factor-kappa-B, o NF-κB, e la proteina attivatrice-1, o AP-1.
Questi traslocano nel nucleo e si legano al promotore del PAES, sovraregolando la produzione di PAE, che viene secreta extracellulare.
Trasferire il surnatante contenente SEAP in una micropiastra con un substrato cromogenico.
SEAP idrolizza il substrato, producendo un prodotto di colore viola-blu. Misurare l'assorbanza.
La neutralizzazione di TLR2 riduce fortemente la produzione di SEAP, indicando TLR2 come me
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