JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 3:11 min. • July 8th, 2025
Inizia con un terreno di coltura cellulare contenente E-Plate, una piastra con microelettrodi d'oro sul fondo di ciascun pozzetto.
Seminare la piastra con cellule tumorali bersaglio, aderendo ai microelettrodi d'oro, formando una barriera fisica tra gli elettrodi.
Trasferire la piastra in un analizzatore di celle e applicare un segnale elettrico.
Le celle aderenti interrompono il flusso di elettroni tra gli elettrodi, provocando un flusso ostacolato di elettroni, misurato come impedenza.
Man mano che queste celle proliferano e aderiscono agli elettrodi, l'impedenza elettrica aumenta proporzionalmente al numero di celle aderenti, consentendo la misurazione in tempo reale.
Introdurre cellule T del recettore dell'antigene chimerico o cellule T CAR che esprimono recettori dell'antigene chimerico. Questi recettori interagiscono con gli antigeni delle cellule tumorali, attivando le cellule T e formando una sinapsi immunologica.
Le cellule CAR T attivate rilasciano sostanze citotossiche, tra cui perforine e granzimi.
Le perforine formano pori nella membrana delle cellule tumorali, facilitando l'ingresso dei granzimi nelle cellule e l'induzione della citolisi.
Ciò favorisce il distacco cellulare, diminuendo l'impedenza elettrica, correlandosi con il potenziale di citolisi delle cellule CAR T.
Per un test di potenza della citolisi in tempo reale, aggiungere da 50 a 100 microlitri di terreno di coltura cellulare target a ciascun pozzetto di una piastra E e misurare l'impedenza di fondo nello strumento analizzatore cellulare.
Staccare le cellule tumorali bersaglio dalla piastra di coltura utilizzando la tripsina. Lavare le cellule in 15 millilitri di terreno di coltura fresco e centrifugare. Risospendere il pellet di cellule tumorali in 5 millilitri di terreno fresco per il conteggio e regolare la densità cellulare alla concentrazione di cellule bersaglio appropriata. Aggiungere le celle al numero appropriato di pozzetti e lasciare la piastra E per 30 minuti a temperatura ambiente per consentire alle celle di depositarsi uniformemente sul fondo dei pozzetti.
Al termine del periodo di equilibratura, posizionare la piastra nell'analizzatore di celle in tempo reale e avviare automaticamente la misurazione dell'impedenza ogni 15 minuti durante la notte. L'adesione e la proliferazione delle cellule bersaglio possono essere tracciate in tempo reale.
La mattina successiva, diluire le cellule CAR effettrici e le cellule T di controllo alla concentrazione appropriata nelle singole provette e rimuovere da 50 a 100 microlitri da ciascun pozzetto della piastra E in modo che il volume finale in ogni pozzetto sia di 100 microlitri. Successivamente, vedere le cellule T effettrici e di controllo nei pozzetti appropriati con i rapporti effettore-bersaglio appropriati in 100 microlitri di terreno per pozzetto. Quindi, equilibrare la piastra per 30 minuti a temperatura ambiente prima di reinserirla nel sistema di analisi della cella.
Per misurare l'efficacia dell'uccisione mediata dalle cellule T delle cellule tumorali bersaglio, monitorare l'uccisione mediata dalle cellule CAR-T per 96 ore.