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Immunologia
0 visualizzazioni • 5:54 min • July 8th, 2025
Prelevare una piastra multipozzetto contenente fibroblasti di topo in terreni privi di siero. Aggiungere diluizioni seriali di anticorpi specifici per il TNFα.
Aggiungi TNFα, una citochina infiammatoria.
incubare. La deprivazione sierica induce stress cellulare, rendendo le cellule suscettibili all'apoptosi mediata dal TNFα.
Il legame del TNFα con i suoi recettori sulle cellule prive di siero innesca cascate di segnalazione intracellulare, attivando la cascata delle caspasi e inducendo l'apoptosi.
Tuttavia, il legame degli anticorpi al TNFα impedisce il legame con il suo recettore, inibendo l'attivazione delle caspasi.
Dopo l'incubazione, aggiungere una miscela di reagenti contenente detergente, un substrato di caspasi proluminescente e un enzima luciferasi insieme a ioni ATP e magnesio. Mescolare e incubare.
Il detergente permeabilizza le membrane, rilasciando le caspasi dalle cellule indotte dal TNFα.
Il substrato bioluminescente contiene un sito di riconoscimento delle caspasi. Specifiche caspasi fendono il substrato, generando aminoluciferina.
La luciferasi ossida il suo substrato, l'aminoluciferina, con conseguente emissione di luce.
Misurare l'intensità della luminescenza per rilevare un calo della luminescenza con l'aumentare delle concentrazioni di anticorpi, indicando la potenza degli anticorpi specifici per il TNFα per neutralizzare il TNFα e prevenire l'apoptosi indotta dal TNFα.
Aggiungere 50 microlitri di sospensione cellulare ai 60 pozzetti interni della piastra del saggio, a partire dalla colonna 2 fino all'11a. Miscelare la sospensione cellulare mediante pipettaggio per aggiungere aliquote alla micropiastra. Trasferire immediatamente 50 microlitri delle diluizioni mappate sulla piastra del saggio.
Per le corsie parallele, erogare le diluizioni ruotando la micropipetta. Le diluizioni mappate possono essere dispensate nei pozzetti nell'ordine seguente. I controlli vengono erogati nei pozzi circostanti.
Diluire il TNF-alfa con 500 microlitri di acqua ultrapura. Miscelare con miscelatore a vortice a 2.200 giri/min. Trasferire in una provetta da 15 mL e, infine, diluire a 40 nanogrammi per mL con terreno di coltura del saggio. Erogare 50 microlitri della soluzione di induzione dell'apoptosi nei 60 pozzetti interni esterni. Erogare microlitri della soluzione di induzione dell'apoptosi nei 60 pozzetti interni del saggio. Infine, incubare per 16 ore.
Il quinto giorno, ricostituire il substrato con la sua soluzione tampone come indicato nelle istruzioni del produttore. Mescolare invertendo cinque volte. Erogare la soluzione di substrato e aggiungere 50 microlitri della soluzione di substrato a ciascun pozzetto del campione nella piastra di analisi. Inoltre, aggiungere il substrato ai controlli. Agitare il saggio in un miscelatore a vortice a 400 giri/min per tre minuti.
Estrarre la piastra di analisi dal miscelatore e incubare a temperatura ambiente. Accendi uno spettrofotometro con lettore di piastre. Aprire il software Softmax Pro o qualsiasi programma equivalente. Caricare la micropiastra nello spettrofotometro e regolare i seguenti parametri.
Attiva la funzione di luminescenza sul tipo di rig nella funzione finale. Regolare l'area del rig escludendo le colonne 1 e 12. Selezionare il tipo di piastra su una micropiastra a fondo trasparente standard a 96 pozzetti. Modifica il tempo di integrazione fino a 1250 millisecondi. Regolare il tempo di agitazione della micropiastra a 10 secondi. Selezionare la parete in cui verranno collocati la sostanza di riferimento, la sostanza analitica e il campione di controllo. Inizia a leggere.