JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 5:54 min. • July 8th, 2025
Prelevare una piastra multipozzetto contenente fibroblasti di topo in terreni privi di siero. Aggiungere diluizioni seriali di anticorpi specifici per il TNFα.
Aggiungi TNFα, una citochina infiammatoria.
incubare. La deprivazione sierica induce stress cellulare, rendendo le cellule suscettibili all'apoptosi mediata dal TNFα.
Il legame del TNFα con i suoi recettori sulle cellule prive di siero innesca cascate di segnalazione intracellulare, attivando la cascata delle caspasi e inducendo l'apoptosi.
Tuttavia, il legame degli anticorpi al TNFα impedisce il legame con il suo recettore, inibendo l'attivazione delle caspasi.
Dopo l'incubazione, aggiungere una miscela di reagenti contenente detergente, un substrato di caspasi proluminescente e un enzima luciferasi insieme a ioni ATP e magnesio. Mescolare e incubare.
Il detergente permeabilizza le membrane, rilasciando le caspasi dalle cellule indotte dal TNFα.
Il substrato bioluminescente contiene un sito di riconoscimento delle caspasi. Specifiche caspasi fendono il substrato, generando aminoluciferina.
La luciferasi ossida il suo substrato, l'aminoluciferina, con conseguente emissione di luce.
Misurare l'intensità della luminescenza per
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