Quantificazione dell'attività di sequestro autofagico di massa nelle cellule di mammifero

L'autofagia di massa comporta il sequestro del carico autofagico e delle proteine citosoliche solubili, tra cui la lattato deidrogenasi o LDH, all'interno degli autofagosomi per la degradazione.

Per valutare il sequestro dell'LDH, che riflette l'attività autofagica di massa, prendere una cuvetta per elettroporazione con cellule affamate di nutrienti trattate con inibitori per bloccare la degradazione autofagico-lisosomiale.

Eseguire l'elettroporazione per interrompere selettivamente la membrana cellulare e rilasciare proteine solubili.

Mescolare il disgregatore cellulare con una soluzione di saccarosio tamponata per preservare i componenti cellulari.

Trasferire la soluzione di disgregazione diluita richiesta in una provetta contenente tampone. Centrifuga per separare l'LDH non sequestrato dall'LDH sequestrato dall'autofagosoma.

Trasferire la soluzione di disgregazione diluita rimanente, contenente la frazione totale di LDH cellulare, in un'altra provetta.

Aggiungere un tampone non contenente tensioattivo ionico a entrambe le provette per estrarre le frazioni di LDH sequestrate e totali.

Centrifugare e trasferire surnatanti contenenti LDH in provette contenenti tampone con piruvato e NADH.

L'LDH converte il piruvato in lattato con l'ossidazione del NADH, diminuendo i livelli di NADH in relazione alla concentrazione di LDH.

Quantificare l'LDH nelle frazioni cellulari sedimentate e totali per determinare il sequestro dell'LDH.

Utilizzando una pipetta, risospendere il pellet di cella per ottenere una sospensione di cellule quasi singole. Trasferire questa sospensione in una cuvetta per elettroporazione da 4 millimetri. Posizionare la cuvetta in un elettroporatore a onda di decadimento esponenziale e scaricare un singolo impulso elettrico a 800 volt, 25 microfarad e 400 ohm.

Utilizzare un nuovo puntale per pipetta per trasferire la cellula che la disgrega in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millimetri contenente 400 microlitri di soluzione di saccarosio tamponata con fosfato ghiacciato e mescolare brevemente mediante pipettaggio. Ripetere il processo di risospensione, disgregazione dell'elettrodo e miscelazione per ogni campione. Se si esegue la procedura per la prima volta, assicurarsi di verificare la disgregazione efficiente e selettiva dell'elettrodo della membrana plasmatica come descritto nel testo.

Per ottenere frazioni di LDH sedimentate, rimuovere 550 microlitri da ciascuna soluzione diluita distrutta da cellule e trasferirla nella propria provetta da microcentrifuga da 2 millilitri contenente 900 microlitri di tampone di risospensione ghiacciato con 0,5% BSA e 0,01% Tween-20. Pipettare brevemente per mescolare. Centrifugare a 18.000 volte g e 4 gradi Celsius per 45 minuti per produrre pellet contenenti LDH sedimentato. Utilizzando l'aspirazione, aspirare accuratamente il surnatante per lasciare i pellet il più asciutti possibile.

Conservare i campioni di LDH sedimentati a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'analisi. Per le frazioni totali di LDH, trasferire 150 microlitri da ciascuna delle soluzioni diluite distrutte con cellule alla propria nuova provetta. Conservali in un congelatore a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'analisi.

Scongelare sia i campioni di LDH sedimentati che quelli totali di LDH su ghiaccio. Una volta scongelato, aggiungere 300 microlitri di tampone di risospensione ghiacciato contenente l'1,5% di Triton X-405 ai campioni totali di LDH. Ruotare i campioni su un rullo in una cella frigorifera per 30 minuti. Successivamente, aggiungere 750 microlitri di tampone di risospensione ghiacciato contenente l'1% di Triton X-405 ai campioni di LDH sedimentati. Utilizzare una pipetta per risospendere i pellet fino a quando la soluzione non è omogenea. Centrifugare tutti i campioni a 18.000 volte g a 4 gradi Celsius per cinque minuti per sedimentare i detriti cellulari non disciolti.

Al termine della centrifugazione, mettere i campioni sul ghiaccio. Determinare i livelli di LDH nei surnatanti utilizzando un classico test enzimatico come descritto nel testo o uno qualsiasi dei numerosi kit disponibili in commercio.