JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 4:33 min. • July 8th, 2025
L'autofagia di massa comporta il sequestro del carico autofagico e delle proteine citosoliche solubili, tra cui la lattato deidrogenasi o LDH, all'interno degli autofagosomi per la degradazione.
Per valutare il sequestro dell'LDH, che riflette l'attività autofagica di massa, prendere una cuvetta per elettroporazione con cellule affamate di nutrienti trattate con inibitori per bloccare la degradazione autofagico-lisosomiale.
Eseguire l'elettroporazione per interrompere selettivamente la membrana cellulare e rilasciare proteine solubili.
Mescolare il disgregatore cellulare con una soluzione di saccarosio tamponata per preservare i componenti cellulari.
Trasferire la soluzione di disgregazione diluita richiesta in una provetta contenente tampone. Centrifuga per separare l'LDH non sequestrato dall'LDH sequestrato dall'autofagosoma.
Trasferire la soluzione di disgregazione diluita rimanente, contenente la frazione totale di LDH cellulare, in un'altra provetta.
Aggiungere un tampone non contenente tensioattivo ionico a entrambe le provette per estrarre le frazioni di LDH sequestrate e totali.
Centrifugare e trasferire surnatanti contenenti LDH in provette contenenti tampone con piruvato
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