JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 visualizzazioni • 3:53 min • July 8th, 2025
Prendere una piastra multipozzetto con diversi macrofagi reporter che ospitano il gene secreto della fosfatasi alcalina embrionale, o SEAP, o un gene della luciferasi secreta sotto promotori inducibili.
Aggiungere terreni contenenti diversi ibridi di nanoparticelle peptidico-oro mescolati con lipopolisaccaridi o LPS ai pozzetti designati.
L'LPS si lega ai recettori toll-like dei macrofagi, o TLR, innescando l'internalizzazione nell'endosoma.
La pompa protonica endosomiale trasporta i protoni all'interno. L'acidificazione innesca la segnalazione dei TLR, attivando i fattori di trascrizione.
Questi fattori inducono l'espressione dei geni reporter, producendo SEAP o luciferasi.
In alternativa, l'internalizzazione dell'LPS insieme agli ibridi fa sì che i gruppi peptidici caricati negativamente sequestrino i protoni luminali, prevenendo l'acidificazione endosomiale e inibendo la segnalazione dei TLR.
Raccogliere il terreno, centrifugare per separare il surnatante e aggiungere i substrati per SEAP e luciferasi.
SEAP converte il suo substrato in un prodotto colorato, mentre la luciferasi catalizza il suo substrato per produrre luminescenza.
Una riduzione dei segnali reporter indica l'efficacia degli ibridi nell'inibizione del segnale dei TLR.
Centrifugare 20 volumi della soluzione ibrida peptide-GNP in provette Eppendorf da 1,5 millilitri a 18.000 volte g per 30 minuti. Scartare con cura i surnatanti. Trasferisci gli ibridi in un unico tubo fresco e lavali due volte con 1 millilitro di PBS. Successivamente, risospendere gli ibridi lavati in un volume di terreno R10. Miscelare volumi uguali degli ibridi concentrati e del terreno R10 contenente LPS in modo tale che la concentrazione finale degli ibridi e dell'LPS sia rispettivamente di 100 nanomolari e 10 nanogrammi per millilitro.
Quindi, rimuovere il terreno di coltura dalla piastra di coltura dei macrofagi. Aggiungere 100 microlitri della miscela ibrida-LPS in ogni pozzetto con tre repliche per ogni condizione. Includi un controllo negativo e un controllo LPS. Incubare a 37 gradi Celsius per 24 ore, quindi trasferire il terreno di ciascun pozzetto in una provetta da centrifuga separata. Centrifugare le provette a 18.000 volte g a 4 gradi Celsius per 30 minuti. Trasferire i surnatanti in una piastra inferiore rotonda fresca da 96 pozzetti.
Per iniziare il test reporter su questi campioni, aggiungere 180 microlitri di soluzione QUANTI-Blue preriscaldata a ciascun pozzetto di una nuova piastra a fondo piatto a 96 pozzetti, quindi trasferire 20 microlitri di surnatanti da ciascun campione in questa piastra. Incubare a 37 gradi Celsius per una o due ore fino a quando il colore blu scuro si sviluppa fino a raggiungere una densità ottica superiore a 1. Successivamente, utilizzare un lettore di piastre per registrare l'assorbimento a 655 nanometri. Quindi, trasferire 10 microlitri di surnatante fresco da ciascun campione in una piastra bianca trasparente a fondo piatto a 96 pozzetti.
Utilizzando un iniettore automatico, aggiungere 50 microlitri della soluzione di luciferasi a ciascun pozzetto e registrare immediatamente la luminescenza pozzetto per pozzetto. Quindi, convalidare l'effetto inibitorio dei potenziali candidati e valutare la specificità del TLR come delineato nel protocollo di testo.