Un test di formazione del fuoco per quantificare i titoli virali negli organi di un topo infetto

Prelevare una piastra multipozzetto contenente un monostrato di cellule di mammifero.

Inoculare i pozzetti con diluizioni seriali di omogeneizzati tissutali contenenti il virus Zika, derivati da diversi organi di un topo infetto.

Al momento dell'ingresso nelle cellule attraverso l'endocitosi, il virus si moltiplica e si allontana per infettare le cellule vicine.

Sovrapporre con una soluzione di metilcellulosa ad alta viscosità, creando una barriera fisica che limita il movimento del virus.

La barriera consente solo l'infezione delle cellule immediatamente vicine, formando focolai di cellule infette, e garantisce che ogni focolaio provenga da una singola particella virale, consentendo una quantificazione accurata.

Fissare le cellule e permeabilizzare la membrana. Aggiungere anticorpi primari che entrano nelle cellule e interagiscono con l'antigene virale.

Introdurre un anticorpo secondario coniugato con perossidasi che si lega all'anticorpo primario.

Aggiungi un substrato cromogenico che viene convertito dalla perossidasi per creare macchie colorate, indicando i focolai delle cellule infette.

Contare i focolai per quantificare il titolo virale nei diversi organi del topo.

Rimuovere i campioni omogeneizzati dal congelatore a meno 80 gradi Celsius e lasciarli scongelare. Con i campioni sul ghiaccio, diluire il virus Zika 10 volte nel primo pozzetto della piastra di diluizione e utilizzare una pipetta multicanale per eseguire diluizioni seriali di 10 volte lungo la piastra, cambiando ogni volta i puntali aggiungendo 20 microlitri di campione in 180 microlitri di terreno di crescita.

Sostituire i puntali delle pipette tra una diluizione e l'altra. Preparare la piastra di formazione della messa a fuoco rimuovendo il terreno dalla piastra a 96 pozzetti a fondo piatto preparata che copre le celle Vero. Per evitare che il monostrato si secchi, aggiungere immediatamente 100 microlitri di diluizione del virus a ciascun pozzetto della piastra Vero. Utilizzare lo stesso set di punte per aggiungere dalla concentrazione più bassa a quella più alta.

Piastre rocciose da un lato all'altro da 2 a 4 volte e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per una o due ore. Riscaldare il 2% di metilcellulosa a temperatura ambiente. Quindi, diluire la soluzione di metilcellulosa al 2% nei terreni di crescita in un rapporto di circa 2 a 1. Dopo l'incubazione, aggiungere 125 microlitri di terreno di coltura in metilcellulosa a ciascun pozzetto delle piastre a 96 pozzetti. Incubare nuovamente a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 32-40 ore.

Per fissare le cellule Vero, in una cappa di biosicurezza, aggiungere 50 microlitri di paraformaldeide al 5% sopra lo strato di metilcellulosa in ciascun pozzetto delle piastre a 96 pozzetti. Incubare per 60 minuti a temperatura ambiente. In alternativa, copri i piatti con parafilm e posizionali a 4 gradi Celsius durante la notte.

Successivamente, utilizzare una pipetta per rimuovere la sovrapposizione e il terreno dalle cellule in un contenitore monouso all'interno della cabina di biosicurezza. Lavare delicatamente con 150 microlitri di PBS per pozzetto. Rimuovere il PBS dalle piastre e rimuovere la piastra dalla cappa di biosicurezza. Ripetere il lavaggio PBS due volte. Quindi, aggiungere 150 microlitri per pozzetto una volta il tampone di lavaggio FFA e lasciare a temperatura ambiente per 5-10 minuti per permeabilizzare le cellule fisse.

Successivamente, utilizzare gli anticorpi Zika primari per rilevare l'infezione. Preparare l'anticorpo primario 4G2 a una concentrazione di 1 microgrammo per millilitro in tampone di colorazione FFA. Estrarre il tampone di lavaggio FFA dalle piastre e aggiungere 50 microlitri dell'anticorpo primario contenuto nel tampone di colorazione FFA a ciascun pozzetto. Quindi, sigillare le piastre con parafilm o pellicola di plastica e incubare per una notte a 4 gradi Celsius.

Preparare l'anticorpo secondario anti-topo marcato con HRP di capra a una concentrazione compresa tra 1 e 5.000 in tampone di colorazione FFA. Dopo aver rimosso la soluzione anticorpale, lavare le cellule tre volte con 150 microlitri di tampone di lavaggio FFA per pozzetto. Rimuovere il tampone di lavaggio scorrendo ogni volta nel lavandino.

Colorare le cellule con l'anticorpo secondario nel tampone di colorazione FFA a 50 microlitri per pozzetto e incubare una o due ore a temperatura ambiente. Successivamente, lavare nuovamente le celle tre volte con il tampone di lavaggio FFA, rimuovendo il tampone di lavaggio sbattendo ogni volta nel lavandino.

Aggiungere 50 microlitri di substrato Trueblue in ogni pozzetto. Attendi da 2 a 15 minuti fino a quando le macchie non sono completamente definite con uno sfondo minimo. Dopo che le macchie sono visibili, lavare delicatamente con acqua usando una mano per proteggere il monostrato dalla forza dell'acqua che scorre. Asciugare al rubinetto su carta assorbente.

Poco dopo, utilizzare un cannocchiale da dissezione per contare manualmente i punti in ciascun pozzetto o utilizzare un contatore di punti automatizzato. Nel software di immunocattura, selezionare una diluizione con focolai facilmente distinguibili tra 20 e 200 per pozzetto per ogni campione e calcolare il titolo in unità di formazione del fuoco per millilitro utilizzando la media dei pozzetti duplicati.