Gli effetti dello stress da taglio sulle piastrine trattate con anticorpi contro i recettori meccanosensoriali

Iniziare con una piastra a più pozzetti contenente plasma ricco di piastrine. Le piastrine esprimono complessi meccanorecettoriali di superficie, che rispondono agli stimoli meccanici.

Il complesso meccanocettore contiene il dominio di legame del ligando extracellulare e la regione macro-glicopeptidica legata al dominio meccanosensoriale.

Introdurre anticorpi anti-meccanorecettori, reticolando con i domini leganti i ligandi dei recettori su piastrine opposte.

Posizionare una goccia della sospensione di plasma trattata con anticorpi tra i gruppi del viscosimetro.

Applicare lo sforzo di taglio, simulando la forza meccanica, allontanando i recettori legati agli anticorpi dalle piastrine, portando alla dissociazione della regione macro-glicopeptidica dal dominio meccanosensoriale.

Ciò innesca un cambiamento conformazionale nel dominio meccanosensoriale, attivando le piastrine e determinando l'espressione di marcatori di superficie.

Trasferire la sospensione piastrinica tranciata in un nuovo pozzetto all'interno della piastra a più pozzetti.

Introdurre un cocktail di molecole marcatrici specifiche marcate con fluorofori che interagiscono con i corrispondenti marcatori di superficie piastrinica e fissare le cellule con una soluzione fissativa.

Nella citometria a flusso, segnali di fluorescenza distinti sono correlati agli effetti dello stress da taglio sulle piastrine trattate con anticorpi.

Per il trattamento con il ligando, aggiungere lentamente l'anticorpo o il ligando di interesse al plasma ricco di piastrine e mescolare delicatamente le piastrine. Durante l'incubazione, accendere il viscosimetro a piastra conica e impostare la temperatura della piastra a 22 gradi Celsius. Dopo 5-10 minuti, trasferire il plasma ricco di piastrine trattato sul viscosimetro a piastra conica a temperatura controllata direttamente al centro della piastra, facendo attenzione che tutto il campione si depositi tra il cono e la piastra nel punto di contatto.

Per applicare il taglio al campione, calcolare il taglio secondo il manuale del viscosimetro e applicare il taglio al campione alla velocità e alla durata appropriate. Al termine dell'applicazione, sollevare il cono di circa 2 millimetri dalla piastra, in modo che il campione rimanga a contatto sia con la piastra che con il cono, e utilizzare una punta per pipetta caricatrice di gel per raccogliere da 5 a 10 microlitri dal centro del volume del campione. Quindi, incubare il campione tranciato con anticorpi contro i marcatori superficiali di interesse per 20 minuti a temperatura ambiente e fissare i campioni in paraformaldeide al 2% per 20 minuti a temperatura ambiente.

Per analizzare i campioni mediante citometria a flusso, raccogliere almeno 20.000 eventi per ciascuna condizione e quantificare la potenza del segnale di ciascun marcatore fluorescente utilizzando il valore di altezza per l'intensità di ciascun fluoroforo. Quindi, utilizzare un controllo negativo con albumina sierica bovina o veicolo per disegnare un cancello escludendo gli eventi fluorescenti di fondo negativi e quantificare la percentuale di eventi all'interno del cancello per tutte le condizioni sperimentali.