JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 visualizzazioni • 3:29 min • July 8th, 2025
Prelevare due micropiastre contenenti vetrini coprioggetti con macrofagi derivati dal midollo osseo o BMM.
Aggiungete i promastigoti metaciclici di Leishmania – lo stadio flagellato allungato – in una piastra e gli amastigoti – lo stadio ovale non flagellato – in un'altra piastra.
Durante l'incubazione, i parassiti si legano ai recettori dei macrofagi, innescando la fagocitosi mediata dal recettore.
Il fagosoma si fonde con i lisosomi e le vescicole derivate dal reticolo endoplasmatico e dall'apparato di Golgi, maturando in un vacuolo parassitoforo.
La diminuzione del pH del vacuolo innesca la differenziazione del promastigote in amastigote e la sua replicazione.
Lavare per rimuovere i parassiti non internalizzati.
Fissare i macrofagi infetti e aggiungere un detergente per permeabilizzare le cellule e i parassiti.
Introdurre un colorante fluorescente di acido nucleico per colorare i nuclei dei macrofagi e dei parassiti.
Monta i vetrini coprioggetti su vetrini e osserva al microscopio a fluorescenza, quantificando i nuclei ospiti più grandi e i nuclei di amastigote più piccoli circostanti.
Confrontare il numero di amastigoti per valutare la loro moltiplicazione all'interno dei macrofagi inizialmente infettati da promastigoti indifferenziati rispetto a quelli infettati da amastigoti replicativi.
Per infettare le cellule con L. Amazonensis, diluire la sospensione del parassita fino alla molteplicità sperimentale appropriata di infezione e aggiungere da 50 a 100 microlitri di parassiti a ciascun pozzetto di tutte le piastre a 6 pozzetti, compresi tutti i punti temporali dell'esperimento. Incubare i macrofagi derivati dal midollo osseo per il periodo e la temperatura di infezione appropriati. Quindi, lavare i pozzetti tre volte con 2 millilitri di PBS fresco a 37 gradi Celsius senza calcio o magnesio per pozzetto e fissare i campioni di punto temporale iniziale con 1,5-2 millilitri di paraformaldeide al 2% per 10 minuti.
Per le piastre corrispondenti ai punti temporali successivi, aggiungere 2 millilitri di terreno macrofagico fresco derivato dal midollo osseo a ciascun pozzetto e rimettere le piastre nell'incubatrice appropriata. Quindi, fissare e lavare le celle per ogni punto temporale rimanente, come appena dimostrato, e conservare i campioni a 4 gradi Celsius in PBS fresco.
Per colorare le cellule con DAPI, sostituire il surnatante con 1,5 millilitri di PBS fresco senza calcio e magnesio, integrato con detergente non ionico allo 0,1% per 10 minuti a temperatura ambiente, seguito da tre lavaggi da 2 millilitri con PBS senza calcio o magnesio. Successivamente, colorare le cellule con 2 microgrammi per millilitro di DAPI in 1 millilitro di PBS per 1 ora a temperatura ambiente.
Dopo tre lavaggi, posizionare i vetrini coprioggetti con la cella rivolta verso il basso su singoli vetrini da microscopio montati con un reagente di montaggio anti-sbiadimento disponibile in commercio. Quindi, per quantificare il numero di cellule infette, utilizzare l'obiettivo a olio ad immersione 100x di un microscopio a fluorescenza e un contatore Emanuel, per identificare il numero di nuclei di amastigote più piccoli raggruppati attorno a ciascun grande nucleo di macrofago colorato con DAPI.