Un test su piastra spot per la valutazione delle risposte allo stress ossidativo nei ceppi batterici
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 visualizzazioni • 5:10 min • July 8th, 2025
Trattare sia la piomelanina che i ceppi batterici non produttori di piomelanina con un agente di prova.
La piomelanina, un pigmento extracellulare, fornisce protezione contro lo stress ossidativo.
L'agente in esame interrompe la biosintesi della piomelanina, riducendone la produzione.
Dopo l'incubazione, eseguire diluizioni batteriche seriali con un tampone contenente l'agente di prova o il solvente del veicolo.
Individuare le diluizioni batteriche su piastre di agar con concentrazioni variabili di perossido di idrogeno, un fattore di stress ossidativo.
Le piastre prive di perossido di idrogeno fungono da controlli.
incubare. Nelle piastre di controllo, i batteri formano colonie.
Nel ceppo produttore di piomelanina non trattato, la piomelanina protegge i batteri dal danno ossidativo indotto dal perossido di idrogeno, con conseguente formazione di colonie pigmentate.
Tuttavia, il ceppo produttore di piomelanina trattato con l'agente in esame, che presenta una riduzione della piomelanina, diventa sensibile allo stress ossidativo, con conseguente morte batterica.
Conta le colonie.
La riduzione del numero e delle dimensioni delle colonie con l'aumento delle concentrazioni di perossido di idrogeno nei ceppi produttori di piomelanina trattati e nei ceppi non produttori di piomelanina trattati e non trattati rispetto ai controlli indica un'aumentata sensibilità batterica allo stress ossidativo.
Per iniziare questa procedura, impostare colture notturne dei ceppi da testare in LB, con e senza NTBC. Il giorno seguente, preparare piastre di agar LB contenenti perossido di idrogeno come fattore di stress ossidativo. Innanzitutto, sciogliere i palloni di agar LB e raffreddare il terreno a circa 50 gradi Celsius a temperatura ambiente.
Quindi, aggiungere il perossido di idrogeno direttamente al mezzo raffreddato alle concentrazioni desiderate. Agitare il pallone per mescolare. Un intervallo di concentrazioni di perossido di idrogeno da 0 a 1 millimolare è un buon punto di partenza. Versate subito i piatti, e fiammate la superficie per eliminare le bolle. La resa è di quattro piastre per 100 millimetri di agar LB. Segnare le piastre con la concentrazione di perossido di idrogeno.
Posizionare le piastre scoperte in una cappa a flusso biologico, con una ventola in funzione per 30 minuti per rimuovere l'umidità in eccesso dalle piastre. I piatti devono essere utilizzati lo stesso giorno in cui vengono preparati. Mentre le piastre si asciugano, lavare e misurare l'OD600 delle colture notturne.
Normalizzare l'OD600 di tutte le colture notturne al valore più basso per l'insieme di ceppi da testare. A tale scopo, determinare il volume di coltura necessario per diluire la coltura al minimo OD600 in un volume totale di 1 millilitro.
Ad esempio, se una coltura ha un OD600 di 3 e l'OD600 più basso per l'insieme di ceppi è 2,5, eseguire il seguente calcolo, che risulterà in 0,833 millilitri come volume di coltura necessario. Mettere 0,833 millilitri di coltura in un tubo per microfuge. Successivamente, calcolare la quantità di LB più NTBC o LB più DMSO necessaria per portare il volume di coltura a 1 millilitro. In questo esempio, la quantità sarebbe di 0,167 millilitri. Mescolare a vortice.
Per mantenere le colture in una concentrazione costante di NTBC o DMSO, eseguire diluizioni seriali di 10 volte delle colture notturne normalizzate in PBS più NTBC o PBS più DMSO. Realizza soluzioni stock di PBS più NTBC e PBS più DMSO che aumentano o diminuiscono, a seconda del numero di ceppi testati.
Per una serie di diluizioni per un ceppo, mescolare 300 micromolari di NTBC o un volume equivalente di DMSO con PBS per ottenere un volume totale di 720 microlitri. Aggiungere 90 microlitri di PBS più NTBC o PBS più DMSO alle provette per microfugi appropriate etichettate per 10 a meno 1 fino a 10 fino a meno 7 diluizioni seriali. Aggiungere 10 microlitri di coltura al tubo di diluizione appropriato da 10 a meno 1.
Mescolare a vortice e trasferire 10 microlitri di 10 alla diluizione meno 1 alla provetta di diluizione 10 a meno 2. Sostituzione dei puntali delle pipette tra una diluizione e l'altra, ripetere l'operazione fino a quando non sono state eseguite tutte le diluizioni.
Individuare 5 microlitri delle diluizioni da 10 a meno 3 attraverso 10 a meno 7 su piastre di perossido di idrogeno LB più in duplicato per ogni ceppo. Utilizzare un puntale per pipetta se sono piastrate delle macchie da diluire più a meno. Non inclinare o inclinare la piastra, fino a quando il liquido non si è asciugato nella piastra. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius. Da 24 a 48 ore, a seconda della varietà. Una volta che sono apparse colonie di buone dimensioni, fotografa le lastre utilizzando una fotocamera CCD sopra un transilluminatore.
Panoramica
Questo studio analizza il ruolo della piomelanina nella protezione dei ceppi batterici dallo stress ossidativo. Trattando sia ceppi produttori che non produttori di piomelanina con un agente di prova, sono stati valutati gli effetti sulla sopravvivenza batterica in condizioni ossidative.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microbiologia
- Risposta allo stress ossidativo
- Saggi biochimici
Sfondo
- La piomelanina è un pigmento extracellulare che offre protezione contro lo stress ossidativo.
- Comprendere i meccanismi di resistenza batterica ai danni ossidativi è fondamentale per sviluppare nuove strategie antimicrobiche.
- Il perossido di idrogeno è comunemente utilizzato come agente stressante ossidativo negli studi microbiologici.
- Questo studio esplora come l'interruzione della biosintesi della piomelanina influisca sulla sopravvivenza batterica.
Scopo dello studio
- Valutare il ruolo protettivo della piomelanina contro lo stress ossidativo nei batteri.
- Determinare l'impatto di un agente in prova sulla produzione di piomelanina.
- Valutare la sensibilità batterica al perossido di idrogeno in ceppi trattati e non trattati.
Metodi Utilizzati
- Sono state preparate colture notturne di ceppi batterici in terreno LB.
- Sono state create piastre di agar LB contenenti concentrazioni variabili di perossido di idrogeno.
- Sono state effettuate diluizioni seriali delle colture per normalizzare le concentrazioni batteriche.
- Le diluizioni batteriche sono state inoculate su piastre di agar e incubate per osservare la crescita delle colonie.
Risultati principali
- I ceppi produttori di piomelanina non trattati hanno mostrato resistenza al perossido di idrogeno.
- I ceppi trattati con ridotta produzione di piomelanina hanno mostrato un aumento della sensibilità allo stress ossidativo.
- Il numero di colonie è diminuito con concentrazioni più elevate di perossido di idrogeno nei ceppi trattati.
- Anche i ceppi non produttori di piomelanina hanno mostrato una sensibilità aumentata quando trattati.
Conclusioni
- La piomelanina svolge un ruolo significativo nella protezione dei batteri dai danni ossidativi.
- L'interruzione della biosintesi della piomelanina aumenta la vulnerabilità batterica allo stress ossidativo.
- Questi risultati potrebbero orientare futuri studi sui meccanismi di resistenza batterica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Direttiva
Questo saggio con piastra a pozzetti consente una rapida valutazione delle risposte allo stress ossidativo batterico, supportando la validazione degli bersagli nella scoperta di agenti antimicrobici mediante l'associazione tra inibizione della biosintesi della piomelanina e aumento della suscettibilità ai danni ossidativi. Il metodo fornisce letture quantitative della vitalità delle colonie in condizioni controllate di stress ossidativo, facilitando l'identificazione meccanicistica di composti che alterano vie batteriche protettive. Offre una piattaforma scalabile e riproducibile per lo screening iniziale di agenti che rendono i patogeni più sensibili agli scatti ossidativi derivati dall'ospite.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica l'ipotesi terapeutica secondo cui l'inibizione della biosintesi della piomelanina aumenta la sensibilità batterica allo stress ossidativo.
- Valore operativo: Consente la validazione funzionale della piomelanina come meccanismo di resistenza mediante un'analisi fenotipica diretta.
- Valore predittivo: Supporta la selezione di portafogli identificando composti che compromettono le difese antiossidanti batteriche.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Fornisce misurazioni quantitative e dipendenti dalla dose della sopravvivenza batterica lungo gradienti di perossido di idrogeno.
- Valore operativo: Standardizza la semina a spot e la diluizione seriale per un screening riproducibile e compatibile con l'alta produttività.
- Scalabilità: Utilizza volumi minimi di reagenti e piastre standard con agar, consentendo l'adattamento a diverse ceppi e condizioni.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza traslazionale: Illustra come l'interruzione di fattori di virulenza batterici come la piomelanina possa potenziare l'efficacia della clearance ossidativa mediata dal sistema immunitario.
- Continuità preclinica: Collega l'interazione con il bersaglio (riduzione del pigmento) all'esito funzionale (sensibilità ossidativa) in un sistema rilevante per la malattia.
- Contenimento del rischio: Riduce i falsi positivi richiedendo sia l'inibizione biochimica sia la risposta fenotipica allo stress.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del target hit all'ottimizzazione del composto leader, in cui la sensibilità allo stress ossidativo funge da biomarcatore funzionale dell'inibizione della via.
- Biologia della scoperta: Convalida il meccanismo del bersaglio collegando l'esposizione all'agente in prova alla perdita della protezione ossidativa in ceppi produttori di piomelanina.
- Screening: Produce sospensioni batteriche normalizzate e pronte per il saggio, con serie di diluizioni quantificabili per uno screening costante dei composti.
- Analisi: Genera dati sul numero e dimensione delle colonie come letture dose-dipendenti per confrontare la sensibilità allo stress ossidativo in diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega la riduzione della piomelanina a una maggiore vulnerabilità in ambienti ossidativi che imitano le risposte immunitarie dell'ospite.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per valutare qualsiasi composto mirato alla biosintesi dei pigmenti batterici o alle difese contro lo stress ossidativo.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce informazioni meccanicistiche sui percorsi di risposta allo stress batterico, riducendo l'ambiguità nella validazione degli obiettivi.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso protocolli standardizzati di normalizzazione delle colture, allestimento dei campioni e incubazione.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione identificando composti che sensibilizzano i batteri a stressori fisiologicamente rilevanti.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei candidati basata sulla valutazione del rischio, selezionando quelli che mostrano un'azione doppia: inibizione del bersaglio più sensibilizzazione fenotipica.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze di microbiologia nella manipolazione delle colture batteriche, nella normalizzazione dell'OD e nelle tecniche anaerobiche, se applicabili.
- Richiede l'accesso a incubatori, sistemi di imaging CCD e preparazione controllata del perossido di idrogeno.
- Necessita di una standardizzazione tra gruppi diversi dei protocolli di diluizione e delle tecniche di inoculo su piastra per garantire la riproducibilità tra laboratori.
- Richiede considerazioni di adattamento per diverse specie batteriche, terreni di coltura e stress ossidativi diversi dal perossido di idrogeno.
- Limitato ai meccanismi associati ai pigmenti extracellulari; potrebbe non applicarsi ai sistemi antiossidanti intracellulari senza modifiche.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Misura Stress ossidativo Resistenza
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Ultimo aggiornamento: 29 agosto 2026