JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 2:20 min. • July 8th, 2025
Prelevare una piastra a più pozzetti contenente diluizioni seriali del composto in esame, un antibiotico aminoglicosidico.
Aggiungere una sospensione di Mycobacterium tuberculosis, un batterio patogeno, nei pozzetti e incubare.
Nel citoplasma, il composto in esame si lega alla subunità ribosomiale micobatterica 30S, inibendo la normale sintesi proteica e portando infine alla morte micobatterica.
Dopo l'incubazione, aggiungere alle colture la resazurina, un colorante idrosolubile debolmente fluorescente. Incubare.
All'interno di micobatteri metabolicamente attivi vitali, gli enzimi deidrogenasi riducono la reazurina di colore blu a una resorufina fluorescente di colore rosa.
Utilizzando un lettore di piastre a fluorescenza, misurare l'intensità della fluorescenza della resorufina nei pozzetti.
Un basso valore di intensità della fluorescenza con l'aumentare delle concentrazioni del composto in esame suggerisce i suoi effetti citotossici contro i micobatteri.
Per eseguire un test della resazurina, coltivare M. tuberculosis in 7H9ADST fino alla fase di metà logaritmica. Diluire la coltura con 7H9ADST a un OD600 di 0,01. Utilizzare 7H9ADST per diluire i composti a due volte le concentrazioni di prova e aliquotare 100 microlitri di ciascun composto diluito in ciascun pozzetto di una piastra trasparente a 96 pozzetti.
Trasferire 100 microlitri della sospensione batterica diluita in ciascun pozzetto. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius in un'incubatrice umidificata per 5 giorni. Sciogliere 10 milligrammi di resazurina in 100 millilitri di acqua deionizzata e sterilizzare la soluzione con filtro. Aggiungere 30 microlitri di soluzione di resazurina ai pozzetti. Quindi, incubare le cellule per 48 ore.
La crescita batterica è indicata da una conversione del colore dal blu al rosa. Effettuare analisi quantitative secondo il protocollo di testo.