JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 visualizzazioni • 4:34 min • July 8th, 2025
Prendi una micropiastra contenente cellule di mammifero su ghiaccio.
Aggiungere un terreno contenente calcio ai pozzetti selezionati e un terreno senza calcio agli altri.
Introdurre monomeri di una tossina batterica che forma i pori. Una bassa temperatura impedisce l'aggregazione dei monomeri, facilitando il legame con il colesterolo della membrana cellulare.
Incubare a una temperatura fisiologica, permettendo ai monomeri legati al colesterolo di oligomerizzarsi e inserirsi nella membrana, formando un poro.
Nei pozzetti con calcio extracellulare, il poro provoca l'afflusso di calcio.
L'afflusso innesca la fuoriuscita esosomiale della tossina e la richiusura della membrana.
L'aumento intracellulare del calcio induce anche l'esocitosi lisosomiale, rilasciando un enzima che converte la sfingomielina della membrana in ceramide.
La membrana arricchita di ceramidi innesca l'endocitosi della tossina, risigillando la membrana.
La risigillatura della membrana è ostacolata in pozzetti privi di calcio extracellulare.
Aggiungere ioduro di propidio o PI – un colorante fluorescente – che non può entrare nelle cellule con una membrana riparata ma entra nelle cellule danneggiate per legare il DNA, emettendo fluorescenza.
Misurare la fluorescenza a intervalli definiti per valutare l'efficienza di richiusura della membrana.
Per impostare un test basato sulla fluorescenza ad alta produttività per le condizioni permissive di riparazione, lavare le cellule due volte con 200 microlitri di terreno M1 a 37 gradi Celsius per pozzetto e aggiungere 100 microlitri di terreno M1 fresco a 37 gradi Celsius integrato con ioduro di propidio 30-micromolare dopo aver scartato il secondo lavaggio.
Per condizioni restrittive di riparazione, lavare le cellule una volta con 200 microlitri di terreno M2 a 37 gradi Celsius integrato con EGTA da 5 millimolari per pozzetto, seguito da un lavaggio con 200 microlitri di terreno M2 da solo.
Dopo aver scartato il secondo lavaggio, aggiungere 100 microlitri di terreno M2 fresco a 37 gradi Celsius integrato con ioduro di propidio da 30 micromolari per pozzetto. Quindi, visualizza la lastra in luce trasmessa, GFP e PI, come appena dimostrato. Durante l'acquisizione dell'immagine della piastra, posizionare una micropiastra in polipropilene a fondo tondo a 96 pozzetti sul ghiaccio e configurare la piastra come appena dimostrato per la lastra precedente.
Per le condizioni permissive di riparazione, aggiungere 100 microlitri di terreno M1 ghiacciato integrato con 60 micromolari di ioduro di propidio per pozzetto, seguiti dall'aggiunta di 100 microlitri di M1 ghiacciato con o senza 4x listeriolisina O per pozzetto.
Per condizioni restrittive di riparazione, aggiungere 100 microlitri di terreno M2 ghiacciato integrato con 60 micromolari di ioduro di propidio per pozzetto, seguiti dall'aggiunta di 100 microlitri di M2 ghiacciato con o senza 4x listeriolisina O per pozzetto.
È imperativo preparare la listeriolisina O alla concentrazione sperimentale appropriata su ghiaccio circa 5 minuti prima dell'inizio del saggio cinetico quando la piastra 1 è su ghiaccio e la piastra 2 è in fase di preparazione.
Al termine dell'imaging della prima piastra, trasferire immediatamente la lastra su un foglio di alluminio su ghiaccio. Dopo 5 minuti, trasferire 100 microlitri da ciascun pozzetto della seconda piastra al pozzetto corrispondente appropriato nella prima piastra raffreddata, inserendo i puntali della pipetta sotto il menisco di soluzione in ciascun pozzetto prima di espellere il volume senza mescolare per una corretta distribuzione della tossina.
Lasciare che la tossina si leghi alle cellule ospiti per 1 minuto e trasferire immediatamente la prima piastra al lettore di piastre per il test postcinetico utilizzando la modalità spettrofluorimetro. Al termine del saggio cinetico, acquisire immediatamente un'immagine postcinetica dell'immagine della lastra come dimostrato per l'imaging precinetico.