Una colorazione immunoistochimica per la rilevazione degli antigeni del virus della rabbia

Inizia con un vetrino che trasporta una sezione di tessuto cerebrale di topo infetta dal virus della rabbia fissata in formalina e inclusa in paraffina. La sezione fissa trattiene gli antigeni virali tramite reticolazione delle proteine.

Trattare il vetrino con una soluzione di xilene per rimuovere la paraffina.

Immergere il vetrino in concentrazioni decrescenti di etanolo per reidratare il tessuto, rendendolo compatibile con le soluzioni acquose.

Introdurre un tampone contenente proteasi per interrompere i legami incrociati delle proteine, migliorando l'accessibilità dell'antigene.

Immergere nel perossido di idrogeno per bloccare le perossidasi endogene e applicare una soluzione bloccante per prevenire interazioni non specifiche.

Introdurre anticorpi primari specifici per l'antigene della rabbia, formando complessi antigene-anticorpo.

Aggiungere anticorpi secondari biotinilati, che si legano agli anticorpi primari. Incubare con gli enzimi perossidasi coniugati con streptavidina, che interagiscono con la biotina.

Introdurre un substrato di perossidasi, producendo un precipitato rosso magenta.

Controcolorare il tessuto con una colorazione nucleare, seguita da un agente azzurrante, colorando i nuclei di blu.

L'immagine immunoistochimica rivela macchie rosso magenta nel citoplasma, confermando la presenza di antigeni della rabbia nella sezione tissutale.

Usando un microtomo, crea una sezione di paraffina di 5 micrometri. Far galleggiare la sezione a bagnomaria a 38 gradi Celsius e raccoglierla su vetrini. Etichettare i vetrini con una penna resistente ai reagenti. Mettere i vetrini su una teglia e scioglierli in forno a 55-60 gradi Celsius per un'ora.

Quindi, rimuovere i vetrini dal forno e deparaffinarli immediatamente utilizzando tre risciacqui consecutivi con xilene di cinque minuti ciascuno. Successivamente, reidratare le sezioni sul vetrino mediante immersioni sequenziali in diluizioni decrescenti di etanolo in acqua deionizzata, come indicato nel protocollo di testo.

Trattare i vetrini con la proteasi per 30 minuti per il recupero dell'antigene proteolitico, quindi sciacquare i vetrini in PBST per 10 minuti e trattarli con perossido di idrogeno al 3% per 10 minuti. Successivamente, lavare nuovamente i vetrini con PBST per 10 minuti.

Per iniziare, rimuovere un vetrino dal tampone, assicurandosi di maneggiare solo un vetrino alla volta, mentre gli altri rimangono sommersi, e utilizzare un tovagliolo di carta per rimuovere il tampone in eccesso intorno alla sezione del tessuto. Posizionare i vetrini in una camera di umidità e incubare con normale siero di capra a temperatura ambiente per 15 minuti.

Successivamente, incubare i vetrini nella camera di umidità con l'anticorpo primario antirabbico di diluizione ottimale predeterminata e gli anticorpi di controllo negativi a temperatura ambiente per 60 minuti senza lavaggi intermedi. Successivamente, lavare i vetrini con PBST per 10 minuti e incubare in una camera di umidità con l'anticorpo biotinilato a temperatura ambiente per 15 minuti.

Lavare nuovamente i vetrini con PBST per 10 minuti. Incubare i vetrini in una camera di umidità con il complesso streptavidina-HRP a temperatura ambiente per 15 minuti e lavare il PBST per 10 minuti. Quindi, incubare con AEC in una camera di umidità a temperatura ambiente per 10 minuti. Lavare i vetrini in acqua deionizzata per 10 minuti e controcolorare con ematossilina di Gill diluita 1 a 2 con acqua deionizzata per due minuti.

Successivamente, risciacquare l'ematossilina in eccesso risciacquando i vetrini in acqua deionizzata. Sciacquare gli scivoli nell'acqua del rubinetto di Scott per 30 secondi e lavarli in acqua deionizzata per 10 minuti. Rimuovere le diapositive una alla volta e montarle con un mezzo di montaggio solubile in acqua. Quindi, usa un microscopio ottico per leggere i vetrini.