Un metodo avanzato di immunoprecipitazione reticolante per l'identificazione efficiente dell'RNA legato alle proteine nei testicoli di topo
JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 5:07 min. • July 8th, 2025
Prendi un testicolo di topo appena raccolto in un tampone refrigerato. Rimuovere la tunica albuginea, lo strato di tessuto fibroso.
Triturare il testicolo per rilasciare tubuli seminiferi contenenti cellule germinali e di Sertoli.
Aggiungere tampone e sottoporre i tubuli a radiazioni UV per la reticolazione irreversibile dell'RNA con le proteine associate, preservando le interazioni.
Centrifugare ed eliminare il surnatante.
Risospendere i tubuli in un tampone di lisi contenente inibitori della RNasi e della proteasi.
Sonicare il tessuto, rilasciando complessi proteina-RNA e altri componenti intracellulari. Gli inibitori della RNasi e della proteasi inattivano le RNasi e le proteasi endogene.
Aggiungere DNasi per degradare il DNA. Introdurre RNasi diluita per la digestione parziale dell'RNA.
Centrifugare e trasferire il surnatante contenente complessi RNA-proteina in una soluzione di biglie magnetiche rivestita di anticorpo con elevata specificità per la proteina legante l'RNA bersaglio.
Applicare un campo magnetico per separare i complessi proteina-RNA legati alle perline. Scartare il surnatante.
Lavare con tampone. Separare magneticamente i complessi proteina-RNA e utilizzarli per
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