JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 6:20 min. • July 8th, 2025
Prelevare cellule di organi linfoidi secondari da un topo immunizzato con l'antigene, contenenti cellule T CD8+ antigene-specifiche in diversi stadi del ciclo cellulare.
G1, S, G2 e M sono stadi di cellule in divisione attiva, mentre le cellule nello stadio G0 sono quiescenti.
Aggiungere un colorante fluorescente per marcare le cellule morte e anticorpi marcati con fluorofori che si legano ai marcatori di superficie delle cellule T CD3 e CD8.
Introdurre i multimeri peptidi-MHC antigenici coniugati con fluorofori per legare i recettori delle cellule T, marcando le cellule T antigene-specifiche.
Utilizzando un tampone, fissare e permeabilizzare le cellule.
Introdurre anticorpi marcati con fluorofori per legare una proteina nucleare associata alla proliferazione cellulare, colorando le cellule che si dividono attivamente.
Aggiungi una colorazione fluorescente per etichettare il DNA.
Utilizzando la citometria a flusso, selezionare le cellule viventi e identificare le cellule T CD8+ antigene-specifiche tramite le etichette legate alla superficie.
L'intensità della colorazione del DNA discrimina le cellule G0 e G1 con una quantità di DNA inferiore dalle cellule S, G2 e M con una quantità di DNA più elevata. L'assenza dell'anticorpo proteina nucleare specifica separa le cellule G0.
Preparare il tampone di lavaggio per permeabilizzazione 1X diluendo il tampone di permeabilizzazione 10X con acqua distillata e filtrarlo attraverso un filtro da 0,45 micrometri per eliminare gli aggregati. Diluire l'anticorpo monoclonale Ki67-FITC in tampone di lavaggio per permeabilizzazione 1X come determinato con un esperimento di titolazione per un volume finale di 100 microlitri per campione.
Aggiungere 3 millilitri del tampone di lavaggio per permeabilizzazione 1X a ciascuna provetta con celle e centrifugare a 400 g per 5 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante. Ancora una volta, aggiungere il tampone di lavaggio per permeabilizzazione 1X e centrifugare per pellettare le cellule, quindi scartare il surnatante.
Aggiungere 100 microlitri di anticorpo monoclonale diluito Ki67-FITC al pellet, quindi agitare e incubare per 30 minuti al buio. Dopo l'incubazione, lavare le cellule due volte con 4 millilitri di tampone di permeabilizzazione 1X, centrifugando dopo ogni lavaggio, ed eliminare il surnatante.
Aggiungere 350 microlitri di PBS al pellet cellulare per i campioni da acquisire direttamente al citometro a flusso e 250 microlitri di PBS al pellet cellulare per i campioni da incubare con Hoechst per la colorazione del DNA. Preparare la soluzione di Hoechst e PBS e aggiungerla a ciascun campione, in modo che la concentrazione finale sia di 2 microgrammi per millilitro. Agitare e incubare i campioni per 15 minuti al buio. Quindi, centrifugare i campioni per 5 minuti e aggiungere 350 microlitri di PBS al pellet cellulare.
Aprire il software e creare diversi gruppi corrispondenti ai diversi organi da analizzare facendo clic su Crea gruppo nella sezione della barra multifunzione dell'area di lavoro. Aprire la finestra Modifica gruppo facendo doppio clic sul nome del gruppo e sincronizzare i gruppi appena creati inserendo un segno di spunta sulla funzione Sincronizzato.
Trascinare ciascun file FCS nel gruppo corrispondente, quindi creare una strategia di controllo a partire da un gruppo LN passante. Aprire la finestra del grafico facendo doppio clic sul campione completamente colorato per visualizzare gli eventi non colorati acquisiti per questo campione in un grafico a punti. Si noti che gli assi x e y sono etichettati come nei file FCS, come indicato nella Tabella 2 del file delle impostazioni del citometro a flusso di questo manoscritto. Verificare che sia visualizzato un numero sufficiente di eventi per una visualizzazione appropriata.
Se necessario, apri Preferenze facendo clic sull'icona a forma di cuore nella barra multifunzione dell'area di lavoro, seleziona Grafici, quindi Dot Plot come tipo di grafico e verifica che il numero di punti disegnati nella casella corrispondente sia corretto o modificalo. Visualizza gli eventi non raggruppati nella finestra del grafico in un grafico a punti con DNA-A sull'asse x e DNA-W sull'asse y. Utilizzare la scala lineare per entrambi gli assi. Se necessario, modificare la scala da logaritmica a lineare facendo clic sulla casella indicata con una T vicino a ciascun asse nella finestra del grafico.
Selezionare una singola popolazione di celle facendo clic su Rettangolo nella sezione Strumenti di controllo, quindi fare doppio clic al centro del cancello rettangolare per visualizzare le singole celle in un grafico a punti con il parametro FSC-A sull'asse x e il colorante delle cellule morte sull'asse y.
Fare clic sul poligono per selezionare la popolazione di cellule vive, che sono negative per il colorante a cellule morte. Fare doppio clic al centro del gate poligonale per visualizzare le celle in un grafico a punti con il parametro FSC-A sull'asse x e il parametro SSC-A sull'asse y.
Fai clic su Rettangolo e crea un gate "rilassato" per includere tutte le singole celle attive in quel grafico. Fare doppio clic al centro del cancello rilassato per visualizzare le celle in un grafico a punti con CD3 sull'asse x e CD8 sull'asse y.
Utilizzare la scala dell'asse appropriata per la visualizzazione nella finestra del grafico. Se necessario, modificare le scale x e y cliccando sulla casella indicata con una T in prossimità di ciascun asse. Scegliere Personalizza funzione asse e modificare le decadi neg extra , la base della larghezza e le decadi positive in base alle esigenze.
Seleziona le celle CD3-positive, CD8-positive cliccando su Poligono. Fare doppio clic al centro del gate CD3-positivo e CD8-positivo per visualizzare le celle in un grafico a punti con Tetr-gag sull'asse x e Pent-gag sull'asse y. Seleziona le cellule T CD8 antigene-specifiche facendo clic su Poligono. Fare doppio clic al centro del gate specifico del bavaglio per visualizzare le celle in un grafico a punti con DNA-A sull'asse x e Ki67 sull'asse y. Selezionare le celle nelle diverse fasi del ciclo delle celle facendo clic su Quad nella sezione Strumenti di iniezione della finestra del grafico.