Perché il test dell'ipotesi nulla è importante per la quantificazione dell'assorbimento da parte dei microglia?

Il test dell'ipotesi nulla garantisce che le differenze osservate nella fagocitosi microgliale siano statisticamente significative, supportando una valida conferma del bersaglio e riducendo i falsi positivi nella fase iniziale della scoperta.

In che modo l'isolamento della variabile indipendente si inserisce nel flusso di lavoro della citometria a flusso?

L'isolamento di variabili come il tipo cellulare e la vitalità mediante marcatura con anticorpi specifici e selezione consente di attribuire con precisione l'attività fagocitica alle microglia, rafforzando le conoscenze meccanicistiche.

Cosa permettono le misurazioni quantitative delle variabili dipendenti in questo saggio?

Le misurazioni quantitative della fluorescenza consentono un confronto diretto dell'assorbimento da parte dei microglia tra diverse condizioni, facilitando decisioni basate sui dati nella selezione e nella priorizzazione degli obiettivi.

Perché i requisiti di replicazione sono fondamentali per la collaborazione interfunzionale?

La riproduzione dei risultati della citometria a flusso tra esperimenti e gruppi di lavoro garantisce la riproducibilità, permettendo una condivisione e un'integrazione affidabili dei dati nei flussi di lavoro più ampi di ricerca e sviluppo.

Quali capacità di analisi statistica sono necessarie prima di implementare letture di citometria a flusso?

Sono necessari strumenti statistici robusti per analizzare i dati di citometria a flusso multiparametrica, valutare la significatività e convalidare i risultati per prendere decisioni successive nei processi biofarmaceutici.

Misurazione dell'assorbimento microgliale di particelle fluorescenti erogate per via intravitreale mediante citometria a flusso

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunologia

0 visualizzazioni • 4:34 min • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inizia con una piastra a più pozzetti contenente una sospensione unicellulare di cellule mieloidi retiniche di topo, tra cui microglia, monociti e neutrofili.

Le microglia, o cellule immunitarie fagocitiche retiniche, mostrano fluorescenza a causa di bioparticelle di origine fungina inghiottite marcate con fluoroforo, preiniettate per via intravitrea.

Centrifugare e aggiungere anticorpi del recettore Fc, bloccando i siti di interazione non specifici."

Introdurre un cocktail di anticorpi marcati con fluorofori che hanno come bersaglio le proteine di superficie CD11b, Ly6C e Ly6G, interagendo con le cellule mieloidi che le esprimono.

Rimuovere gli anticorpi non legati. Trattare con ioduro di propidio, che permea attraverso le membrane danneggiate, colorando esclusivamente le cellule morte.

Nella citometria a flusso, eccitare lo ioduro di propidio per escludere le cellule morte e identificare le cellule vive non fluorescenti.

Illuminare le cellule con un laser viola; le cellule vive eccitate indicano le cellule mieloidi che esprimono CD11b.

Successivamente, illuminare con un laser rosso, eccitando il fluoroforo rosso vicino lontano all'interno delle cellule CD11b-positive, indicando i monociti che esprimono Ly6C e i neutrofili che esprimono Ly6G.

Eccitare le cellule con un laser blu; l'emissione di fluorescenza verde dalle restanti cellule CD11b-positive conferma l'assorbimento microgliale delle particelle fluorescenti.

Tre ore dopo l'iniezione intravitreale, utilizzare una pinza con angolo di 45 gradi per premere delicatamente contro la palpebra per proptosare il bulbo oculare. Posiziona la pinza dietro il bulbo oculare e tira. Quindi, trasferire il bulbo oculare nell'area asciutta di una capsula di Petri contenente un piccolo volume di PBS con calcio e magnesio al microscopio da dissezione e utilizzare una punta della pinza superfine per perforare l'occhio nel limbus corneale. Successivamente, tenendo il bulbo oculare con una pinza angolata di 45 gradi, usa le forbici a molla per tagliare intorno al limbus corneale fino a tagliare circa la metà della circonferenza.

Trasferisci il bulbo oculare nella PBS e usa un secondo paio di pinze sottili con angolo di 45 gradi per strappare la cornea e la sclera. Il cristallino e la retina usciranno intatti. Assicurati che il cristallino e la retina siano separati e trasferisci la retina in una provetta di polistirene da 5,4 millilitri contenente 2 millilitri di PBS con calcio e magnesio.

Per ottenere una sospensione unicellulare delle cellule retiniche, utilizzare un kit di dissociazione del tessuto neuronale secondo le istruzioni del produttore e risospendere le cellule in 200 microlitri di tampone di colorazione. Quindi, trasferire il campione in un pozzetto di una piastra con fondo a U a 96 pozzetti. Dopo la centrifugazione, capovolgere la piastra per scartare il surnatante e bloccare i recettori FC con 25 microlitri di tampone colorante contenente anticorpi CD16/CD32 per pozzetto per 5 minuti a temperatura ambiente. Quindi, etichettare le cellule con gli anticorpi di interesse per 15 minuti a temperatura ambiente al buio.

Quindi, pellettare le celle e seguire un lavaggio in 200 microlitri di tampone di colorazione fresco per pozzetto. Ora, risospendere i pellet in 200 microlitri di tampone colorante e colorante vitalizzante e trasferire i campioni in provette per microtitolazione da 1,2 millilitri. Quindi, lavare i pozzetti con altri 100 microlitri di tampone di colorazione e colorante di vitalità e raggruppare i lavaggi con i campioni corrispondenti per l'analisi mediante citometria a flusso.