JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 visualizzazioni • 2:22 min • July 8th, 2025
Inizia con una piastra di imaging a base di vetro contenente una sospensione di neutrofili umani o cellule immunitarie e visualizzala sotto un sistema di imaging a fluorescenza.
Introduci conidi reporter fluorescenti geneticamente modificati di Aspergillus o spore fungine e acquisisci immagini a intervalli regolari fino a 6 ore.
Le spore fungine esprimono proteine fluorescenti rosse e sono marcate esternamente con fluorofori magenta non degradabili, aiutando a distinguere le cellule morte da quelle vive.
Durante l'incubazione, i neutrofili interagiscono con le molecole associate ai patogeni sui conidi attraverso i recettori di riconoscimento dei modelli, facilitando il loro inghiottimento all'interno di un fagosoma.
Successivamente, il fagosoma si fonde con il lisosoma contenente l'enzima, formando un fagolisosoma.
All'interno del fagolisosoma, le specie reattive dell'ossigeno e gli enzimi degradano i conidi.
Durante l'imaging di cellule vive, al punto temporale iniziale, la fluorescenza rossa e magenta intensa all'interno del fagosoma dei neutrofili indica la presenza di conidi vivi.
Nel tempo, una diminuzione della fluorescenza rossa con la ritenzione della fluorescenza magenta indica la degradazione dei conidi, confermando l'attività antifungina dei neutrofili.
Per visualizzare DsRed e AlexaFlour 633 durante la microscopia, preriscaldare un riscaldatore per microscopio e accendere il microscopio e il computer. Quindi, aggiungere 100 microlitri di 3 volte 10 al 6° per millilitro di sospensione di conidi FLARE nei pozzetti appropriati della capsula di imaging. Registrare l'ora in cui vengono aggiunti i conidi FLARE.
Montare la piastra di imaging sul tavolino del microscopio. Quindi, nelle impostazioni di acquisizione, impostare la potenza laser su 10% e il tempo di esposizione su un secondo, regolare la sensibilità della fotocamera per un'immagine chiara ma non sovraesposta di DsRed e AF 633 e impostare un elenco di punti del palco. Inizializza l'imaging quando tutti i punti sono a fuoco, i canali fluorescenti sono ottimizzati e il tempo di ciclo e la durata sono impostati.