Un saggio cellulare per l'identificazione di agenti che interagiscono con CXCR4

Prelevare una piastra multipozzetto rivestita di gelatina contenente cellule tumorali cerebrali umane aderenti che esprimono CXCR4.

Sostituire il terreno con un colorante sensibile al calcio. Le esterasi intracellulari scindono il colorante in un prodotto impermeabile alla membrana che si lega agli ioni calcio, mostrando una maggiore fluorescenza.

Rimuovere il colorante, lavare e aggiungere il tampone.

Posizionare la piastra in un lettore di micropiastre a fluorescenza con il composto che interagisce con CXCR4 e le piastre contenenti chemochine CXCL12.

Utilizzando parametri automatizzati impostati, iniettare concentrazioni crescenti di composti nei pozzetti di prova, seguite da una specifica concentrazione di CXCL12.

Nei pozzetti di controllo senza il composto, CXCL12 si lega a CXCR4.

Questo legame attiva una cascata di segnalazione, rilasciando ioni calcio nel citoplasma, dove si legano al colorante, intensificando la fluorescenza.

Tuttavia, nei pozzetti di prova, i composti interagenti inibiscono il legame di CXCL12 a CXCR4, influenzando la mobilizzazione del calcio e causando una diminuzione della fluorescenza dose-dipendente, confermandoli come antagonisti di CXCR4.

Il giorno del passaggio cellulare, rivestire ogni pozzetto di una piastra di polistirene a 96 pozzetti a parete nera con fondo trasparente con 100 microlitri di soluzione di gelatina allo 0,1% e incubare le piastre per due ore a temperatura ambiente. Mentre la gelatina si sta solidificando, utilizzare una soluzione di tripsina-EDTA per sollevare le cellule di interesse dal fondo del loro pallone di coltura, risospendendo le cellule in un terreno di crescita fresco in un tubo conico da 50 millilitri una volta che si sono staccate.

Dopo il conteggio, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospendere il pellet in un terreno di crescita fresco a una concentrazione di 1 x 10⁵ cellule vitali per millilitro. Quando le piastre sono pronte, scartare la soluzione di gelatina in eccesso e asciugare le piastre su un fazzoletto di laboratorio. Quindi, lavare i pozzetti con 200 microlitri di PBS e sostituire il lavaggio con 200 microlitri di cellule per pozzetto, per un'incubazione notturna a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

La mattina successiva, picchiettare la piastra per scartare il terreno di coltura dai pozzetti e asciugare la piastra capovolta su un tovagliolo di carta. Quindi, etichettare le cellule in ciascun pozzetto con 100 microlitri di soluzione di colorante di caricamento per pozzetto e incubare la piastra per 45 minuti al buio a temperatura ambiente. Mentre le cellule sono in incubazione, aggiungere 75 microlitri di CXCL12 per pozzetto alla piastra per chemochine e 50 microlitri del composto di interesse a ciascun pozzetto della piastra composta.

Quindi, accendere l'unità di raffreddamento del lettore di piastre a fluorescenza, quindi il lettore di piastre stesso. Dopo aver lasciato che il sistema si avvii per alcuni minuti, aprire il software del lettore di piastre. Per impostare il protocollo del saggio, nella scheda Impostazioni, selezionare Modalità di lettura e la lunghezza d'onda di eccitazione ed emissione appropriata per il colorante di caricamento.

Selezionare la scheda "Miscela con fluido di trasferimento" per la miscelazione automatica dei composti nella piastra composta. Nella scheda "Trasferimento fluido", posizionare 20 microlitri di ciascun pozzetto dalla piastra del composto da trasferire nella piastra di misurazione e posizionare i puntali della pipetta a 20 microlitri sotto la superficie del liquido. Impostare la velocità di aspirazione a 50 microlitri al secondo e la velocità di erogazione a 25 microlitri al secondo e fare clic su "Leggi con fluido di trasferimento".

Durante il primo intervallo, selezionare 60 letture con un intervallo di lettura di un secondo, con 10 letture da registrare prima che i composti vengano dispensati nella piastra di misurazione e 50 letture da completare dopo. Impostare il secondo intervallo con l'intervallo di lettura di 30 secondi e 18 letture. Selezionare tre lavaggi delle punte per il protocollo, impostando ogni fase di lavaggio in modo che includa il fluido di lavaggio appropriato, un ciclo di lavaggio, una velocità della pompa elevata e cinque colpi per lavaggio.

Utilizzare la funzione "Pausa pipettatore" per includere una pausa del pipettatore di 300 secondi e utilizzare l'impostazione "Miscelare con fluido di trasferimento" per consentire la miscelazione automatica della soluzione CXCL12 all'interno della piastra per chemochine. Nella successiva scheda "Transfer Fluid", impostare 25 microlitri da ciascun pozzetto della piastra per chemochine da trasferire alla piastra di misurazione e posizionare i puntali 20 microlitri sotto la superficie del liquido. Impostare la velocità di aspirazione a 50 microlitri al secondo e la velocità di erogazione a 25 microlitri al secondo.

Utilizzare il pulsante "Leggi con fluido di trasferimento" per impostare il primo intervallo in modo che includa 145 letture con un intervallo di lettura di un secondo. Impostare il secondo intervallo su un intervallo di lettura di sei secondi e 20 letture. Seleziona altri tre cicli di punte di lavaggio, quindi fai clic su "Imposta stage Temperatura" e imposta la temperatura del dispositivo su 37 gradi Celsius.

Al termine dell'incubazione del colorante di caricamento, scartare il tampone dalla piastra di misurazione e asciugare la piastra su un fazzoletto di laboratorio. Lavare le cellule con 150 microlitri per pozzetto di tampone per saggio, sostituendo il tampone con 80 microlitri di tampone per saggio dopo due minuti. Posizionare la piastra di misurazione nella posizione di lettura, la piastra composta nella posizione sorgente 2, la piastra per chemochine nella posizione sorgente 3 e una scatola di punte nere nella posizione sorgente 1.

Chiudere il dispositivo e fare clic su "Protocol Signal Test" per determinare le unità di luce relativa allo sfondo e le varianti di fluorescenza sulla piastra. Seleziona Test "Segnale" nella finestra pop-up. Se si ottengono valori di sfondo compresi tra 8.000 e 10.000 unità di luce relativa, selezionare "Aggiorna" e fare clic su "Salva" per salvare il protocollo principale.