Misurazione in vitro dell'attività enzimatica della α-galattosidasi A e dell'acido α-glucosidasi
JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 3:20 min. • July 8th, 2025
La α-galattosidasi A e la α-glucosidasi acida sono enzimi lisosomiali cruciali per il metabolismo cellulare.
La α-galattosidasi A scompone substrati come i glicolipidi, mentre la α-glucosidasi acida idrolizza il glicogeno.
Per misurare la loro attività enzimatica in vitro, prelevare pozzetti per piastre a più pozzetti con campioni contenenti concentrazioni note rispettivamente di α-galattosidasi A e di α-glucosidasi acida.
Aggiungere ai pozzetti il volume richiesto di soluzioni acide di substrati sintetici di 4-metilumbelliferile, substrati fluorogenici specifici progettati per imitare i substrati naturali di questi enzimi.
Incubare al buio.
La α-galattosidasi A e gli enzimi acidi α-glucosidasi scindono i rispettivi substrati, rilasciando il prodotto fluorescente, il 4-metilumbelliferone.
Aggiungere un tampone alcalino per terminare la reazione enzimatica.
Utilizzando un lettore di fluorescenza per micropiastre, misurare l'intensità di fluorescenza del 4-metilumbelliferone nei pozzetti, indicativa della sua concentrazione, per determinare rispettivamente l'attività enzimatica della α-galattosidasi A e dell'acido α-glucosidasi.
Diluire la quantità calcolata di ciascun campione e pip
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici