JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 3:20 min. • July 8th, 2025
La α-galattosidasi A e la α-glucosidasi acida sono enzimi lisosomiali cruciali per il metabolismo cellulare.
La α-galattosidasi A scompone substrati come i glicolipidi, mentre la α-glucosidasi acida idrolizza il glicogeno.
Per misurare la loro attività enzimatica in vitro, prelevare pozzetti per piastre a più pozzetti con campioni contenenti concentrazioni note rispettivamente di α-galattosidasi A e di α-glucosidasi acida.
Aggiungere ai pozzetti il volume richiesto di soluzioni acide di substrati sintetici di 4-metilumbelliferile, substrati fluorogenici specifici progettati per imitare i substrati naturali di questi enzimi.
Incubare al buio.
La α-galattosidasi A e gli enzimi acidi α-glucosidasi scindono i rispettivi substrati, rilasciando il prodotto fluorescente, il 4-metilumbelliferone.
Aggiungere un tampone alcalino per terminare la reazione enzimatica.
Utilizzando un lettore di fluorescenza per micropiastre, misurare l'intensità di fluorescenza del 4-metilumbelliferone nei pozzetti, indicativa della sua concentrazione, per determinare rispettivamente l'attività enzimatica della α-galattosidasi A e dell'acido α-glucosidasi.
Diluire la quantità calcolata di ciascun campione e pipettarlo in provette di reazione fresche da 1,5 millilitri per ottenere 0,05 microgrammi di alfa-galattosidasi A o 0,5 microgrammi di alfa-glucosidasi acida per microlitro di soluzione. Agitare nuovamente i campioni per 5 secondi, pipettare 10 microlitri di questa diluizione e duplicarli in una piastra a 96 pozzetti.
Avviare le reazioni aggiungendo 20 microlitri della rispettiva soluzione di substrato. Per l'alfa-galattosidasi A, aggiungere 2 millimolari di 4-metilumbelliferil-alfa-D-galattopiranoside o 4-MU-Gal in tampone citrato di fosfato molare 0,06, pH 4,7. Per l'alfa-glucosidasi acida, aggiungere 2 millimolari di 4-metilumbelliferil-alfa-D-glucopiranoside o 4-MU-Glu in acetato di sodio 0,025 molari, pH 4,0.
Incubare le reazioni enzimatiche per 1 ora al buio a 37 gradi Celsius e 300 giri/min su un agitatore orbitale. Quindi, terminare la reazione aggiungendo 200 microlitri di tampone idrossido di sodio glicina 1,0 molare a pH 10,5. Preparare una curva standard di 4-MU da un impasto di 0,01 milligrammi per millilitro secondo il protocollo di testo e pipettare 10 microlitri di soluzioni in doppio in una piastra a 96 pozzetti.
Aggiungere 200 microlitri di tampone idrossido di sodio glicina molare 1,0 molare a ciascun pozzetto per regolare il volume e il pH. Infine, misurare l'attività enzimatica in un lettore di fluorescenza dotato del set di filtri appropriato e analizzare i dati utilizzando il software appropriato per il dispositivo di lettura della fluorescenza.