Un test per valutare l'effetto dei composti in esame sull'ingresso e la fusione virale nelle cellule ospiti

Prendi le cellule tumorali del fegato e incubale a bassa temperatura per compromettere l'endocitosi.

Introdurre un virus dell'epatite C ricombinante o HCV, comprendente un genoma di RNA ingegnerizzato che codifica per un reporter di luciferasi secreta.

Le lipoproteine virali interagiscono con i proteoglicani sulle cellule ospiti, mentre le glicoproteine dell'involucro virale si legano a specifici recettori dell'ospite.

In pozzetti selezionati, aggiungere il composto di prova che si lega alle glicoproteine virali.

Dopo l'incubazione a temperatura fisiologica, i virus legati vengono endocitizzati.

Scartare i virus non internalizzati, aggiungere un terreno di coltura e incubare.

Nei pozzetti non trattati, le glicoproteine aiutano la fusione dell'involucro virale e dell'endosoma, rilasciando il nucleocapside, mentre il mascheramento dei composti compromette la fusione nei pozzetti trattati.

Al momento del rilascio, l'RNA esprime proteine virali, tra cui la luciferasi che viene secreta extracellulare.

Raccogli il surnatante contenente luciferasi e aggiungi un substrato bioluminescente, che viene ossidato dalla luciferasi per emettere luce.

Una diminuzione della luminescenza nei pozzetti trattati rispetto a quelli non trattati indica l'inibizione della fusione virale involucro-endosoma.

Per analizzare la fusione virale e l'ingresso, raffreddare preventivamente la piastra di coltura cellulare a 4 gradi Celsius per un'ora dopo l'incubazione notturna per l'adesione cellulare. Rimuovere il terreno esistente dai pozzetti e infettare le cellule con 10 al secondo FFU HCV su ghiaccio.

Incubare la piastra a 4 gradi Celsius per tre ore. Lavare delicatamente le cellule due volte con 200 microlitri di PBS ghiacciato per rimuovere il virus non aderito. Quindi, con ghiaccio, trattare le cellule con un composto di prova disciolto in terreno basale o terreno basale con DMSO all'1% come controllo e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per tre ore. Ciò consente la valutazione dei composti in esame all'ingresso virale, che avviene a 37 gradi Celsius.

Aspirare il terreno e lavare due volte i virus non internalizzati con 200 microlitri di tampone citrato o PBS. Aggiungere 100 microlitri di terreno basale per pozzetto e incubare a 37 gradi Celsius per altre 72 ore. Raccogliere il surnatante ed eseguire il test della luciferasi Gaussia come dimostrato in precedenza per rilevare il reporter della luciferasi rilasciato.