JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 3:04 min. • July 8th, 2025
Inizia con un DNAzima che scinde l'RNA, un DNA catalitico che, legandosi a uno specifico biomarcatore batterico, viene attivato.
Il DNAzima è legato a una perlina magnetica rivestita di streptavidina tramite biotina alla sua estremità 5'. All'estremità 3', è legato a un'ureasi legata a oligonucleotidi, formando una perlina magnetica funzionale.
A un tubo contenente perline magnetiche funzionali, aggiungere un lisato di E. coli.
Uno specifico biomarcatore di E. coli dal lisato, attiva il DNAzima, innescando la scissione del legame RNA, causando il distacco del coniugato DNAzima-ureasi.
Utilizzare un supporto magnetico per immobilizzare le perle e rimuovere il coniugato DNAzyme-ureasi legato alle perline.
Trasferire il surnatante contenente ureasi rilasciato in un'altra provetta.
Aggiungere un colorante indicatore di pH, rosso fenolo, e una soluzione di urea.
L'ureasi idrolizza l'urea in ammoniaca e anidride carbonica.
L'ammoniaca, una base debole, aumenta il pH della soluzione, provocando un viraggio di colore, che indica la presenza del biomarcatore E. coli.
Dopo aver preparato le cellule di E. coli secondo il protocollo di testo, prelavare un tubo di microfuga da 1,5 millilitri aggiungendo e agitando 100 microlitri di RB. Quindi, eliminare il buffer.
Aggiungere 15 microlitri di EC1 assemblato al tubo lavato, quindi posizionare il tubo sulla griglia magnetica e aspirare il surnatante. Estrarre la provetta dal rack, aggiungere 100 microlitri di RB e risospendere con cura le perline magnetiche.
Dopo aver usato l'RB per lavare le perle altre due volte e aver rimosso l'RB, aggiungere 10 microlitri del campione di E. coli alla provetta e mescolare delicatamente il contenuto picchiettando sulla provetta. Quindi, incubare la reazione a temperatura ambiente per un'ora.
Dopo l'incubazione, aggiungere 90 microlitri di acqua bidistillata e posizionare la provetta sulla rastrelliera magnetica. Dopo circa tre minuti di separazione magnetica, trasferire con cura 85 microlitri di surnatante in una provetta per microfuga da 0,5 millilitri.
È molto importante pipettare accuratamente la soluzione senza assorbire nessuna delle perle magnetiche. Queste perle sono caricate con ureasi e genereranno un falso segnale positivo.
Aggiungere 15 microlitri di rosso fenolo allo 0,04% e 100 microlitri di soluzione di substrato. Quindi, scatta fotografie a intervalli di tempo specifici per registrare un cambiamento di colore.