Un test reporter sulla luciferasi per studiare la regolazione della traduzione nelle cellule infettate da poxvirus

Prendiamo i complessi di trasfezione che comprendono mRNA reporter che codificano per la luciferasi della lucciola, o Fluc, e la luciferasi Renilla, o Rluc.

L'mRNA di Fluc contiene una sequenza di poliadenosina 5', o un leader di poli(A), mentre l'mRNA di Rluc manca di questa sequenza.

Trasfettare le cellule di mammifero non infette e infette da poxvirus per rilasciare gli mRNA reporter e incubare.

Nelle cellule non infette, i fattori di inizio eucariotici si legano al cappuccio 5' dell'mRNA, seguiti dal reclutamento della piccola subunità ribosomiale e di un tRNA iniziatore.

Quando la subunità piccola localizza il codone di inizio, la subunità grande si unisce per sintetizzare le proteine della luciferasi.

Nelle cellule infette, la fosforilazione mediata dal poxvirus della piccola subunità provoca l'assemblaggio del ribosoma direttamente sulla sequenza leader, aumentando la produzione di Fluc.

Lisi le cellule per rilasciare le luciferasi.

Aggiungere il substrato Fluc, che l'enzima ossida, emettendo luce. Utilizzando un lettore di piastre, misurare la luminescenza.

Ripetere il passaggio per Rluc per determinare l'aumento relativo della luminescenza Fluc rispetto a Rluc nelle cellul