Microscopia quantitativa time-lapse per la valutazione della disseminazione batterica dipendente dalla rigidità della matrice extracellulare

Prelevare una piastra a più pozzetti con monostrati di cellule endoteliali umane aderenti su idrogel di poliacrilammide rivestiti di collagene di rigidità variabile.

Le cellule su idrogel più rigidi subiscono una significativa riorganizzazione citoscheletrica, aumentando la tensione intracellulare, rispetto agli idrogel più morbidi.

Lavare le cellule con terreni e aggiungere Listeria monocytogenes ingegnerizzata, che esprime una proteina fluorescente sotto il promotore della proteina che induce l'assemblaggio dell'actina (ActA).

Centrifuga per facilitare il contatto cellula-batteri. Incubare per mediare l'endocitosi batterica.

Lavare con mezzi leggeri. Trattare con gentamicina per eliminare i batteri non internalizzati. Incubare.

I batteri internalizzati rilasciano tossine che formano pori, distruggendo le membrane fagosomiali. I batteri citosolici sovraregolano l'espressione di ActA e della proteina fluorescente, marcando i batteri intracellulari.

Le proteine ActA inducono la polimerizzazione dell'actina, formando una coda di cometa di actina che spinge i batteri in avanti, causando l'internalizzazione da parte delle cellule vicine e promuovendo la disseminazione.

Dopo l'incubazione, utilizzare terreni contenenti coloranti per colorare i nuclei cellulari. Sostituire i terreni con terreni contenenti gentamicina.

Eseguire la microscopia time-lapse.

Gli idrogel più morbidi promuovono una rapida diffusione intercellulare dei batteri rispetto agli idrogel più rigidi con una maggiore tensione intracellulare, suggerendo una disseminazione batterica dipendente dalla rigidità della matrice.

Dopo aver preparato una coltura notturna di L. monocytogenes secondo il protocollo di testo, trasferire 1 millilitro di coltura in una provetta da microcentrifuga e centrifugarla a 2.000 volte g e temperatura ambiente per 4 minuti. Dopo aver utilizzato il PBS per coltura tissutale per lavare due volte il pellet, utilizzare 1 millilitro di PBS per risospendere il pellet.

Preparare la miscela di infezione combinando 10 o 50 microlitri di sospensione batterica con 1 millilitro di terreno pieno MCDB-131 per una molteplicità di infezioni, o MOI, di circa 50 batteri per cellula ospite o 10 batteri per cellula ospite. Rimuovere il terreno dai pozzetti delle piastre a 24 pozzetti, facendo attenzione a non distruggere gli idrogel o le cellule.

Utilizzare 1 millilitro di terreno pieno MCDB-131 per lavare le cellule una volta, quindi aggiungere 1 millilitro di batteri a ciascun pozzetto. Metti il coperchio sui piatti e avvolgili con pellicola per alimenti in polietilene per evitare perdite. Centrifugare le piastre a 2.000 x g per 10 minuti per sincronizzare l'invasione. Quindi, incubare le colture a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Con il terreno pieno MCDB-131, lavare i campioni 4 volte e rimetterli nell'incubatore per colture tissutali. Dopo altri 30 minuti, sostituire il terreno con MCDB-131 full medium integrato con 20 microgrammi per millilitro di gentamicina.

Dopo aver seminato le cellule HMEC-1 su idrogel di PA e aver trattato con gentamicina secondo il protocollo di testo, incubare la piastra per cinque ore per consentire al promotore ActA di accendersi e guidare l'espressione del frame di lettura aperto mTagRFP.

Quattro ore dopo l'infezione, mescolare 1 microlitro di colorante Hoechst da 1 mg/ml con 1 millilitro di terreno pieno L15 e aggiungerlo a ciascun pozzetto per colorare i nuclei. Dopo aver incubato le cellule per 10 minuti, sostituire il terreno con 1 millilitro di terreno completo L15 integrato con 20 microgrammi per millilitro di gentamicina.

Acquisisci immagini di più posizioni ogni 5 minuti utilizzando una funzione di messa a fuoco automatica per monitorare il modo in cui i batteri LM si diffondono attraverso i monostrati HMEC-1 seminati su idrogel a rigidità variabile.