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Immunologia
0 visualizzazioni • 2:48 min • July 8th, 2025
Inizia con un campione contenente virus ottenuto da una cornea suina infetta trattata con un farmaco antivirale.
Eseguire una diluizione seriale del campione per creare una sequenza di concentrazioni di virus decrescenti.
La diluizione ottimale previene l'infezione di una singola cellula da parte di più virus.
Introdurre i campioni diluiti in un monostrato di cellule ospiti e incubare.
Il virus si attacca al recettore della cellula ospite, entra nella cellula e ne avvia la replicazione. La cellula infetta lisi, rilasciando virioni.
Aggiungere la metilcellulosa, una sostanza viscosa che confina i virus nelle cellule vicine.
Successivamente, i virus causano la morte cellulare e la formazione di placche nella regione infetta.
Aggiungi metanolo per fissare le cellule.
Usa il cristallovioletto per colorare le cellule vive.
Osservare le placche come zone chiare che indicano cellule infette e morte cellulare, circondate da cellule non infette colorate di cristallovioletto.
Infine, contare il numero di placche alla massima diluizione per quantificare il titolo virale nella soluzione iniziale per determinare l'efficacia del farmaco antivirale.
Per quantificare la quantità di virus raccolta da ciascuna cornea, preparare una diluizione log10 di una volta del virus in terreno privo di siero in provette da microcentrifuga fino a raggiungere una diluizione di 1 x 10-8.
Dopo aver aspirato il terreno di crescita da ciascun pozzetto di cellule, trasferire 1 millilitro di ciascuna diluizione virale, iniziando da 1 x 10-3 ai monostrati cellulari placcati, e porre le cellule infette nell'incubatore di coltura cellulare per due ore. Al termine dell'incubazione, lavare delicatamente ogni pozzetto 2 volte con PBS prima di aggiungere 2 millilitri di terreno carico di metilcellulosa a ciascun pozzetto per un'incubazione di 72 ore, o fino a quando non si può osservare la formazione di placche.
Dopo l'osservazione della placca, aggiungere lentamente 1 millilitro di metanolo all'angolo di ciascun pozzetto per un'incubazione di 15 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, aspirare lentamente il contenuto da ciascun pozzetto senza disturbare il monostrato cellulare.
Quindi, etichettare ogni pozzetto con 1 millilitro di soluzione di lavoro in cristallovioletto, facendo attenzione che tutte le cellule siano coperte per un'incubazione di 30 minuti al riparo dalla luce. Al termine dell'incubazione, scartare la soluzione e asciugare i pozzetti su un foglio di carta assorbente. Quindi, contare il numero di placche alla massima diluizione per quantificare il contenuto totale di virus nella soluzione iniziale per 3 volte.