Perché la riduzione delle placche conferma l'efficacia antivirale in questo saggio?

Una diminuzione delle unità formanti placche indica che il farmaco antivirale inibisce la replicazione virale, la diffusione o entrambe, fornendo una prova diretta dell'efficacia. Questa metrica consente la quantificazione della potenza del farmaco mediante analisi della risposta alla dose.

In che modo la diluizione seriale migliora l'accuratezza nella misurazione del titolo virale?

La diluizione seriale garantisce che singoli virioni infettino cellule singole, impedendo sovrapposizioni e consentendo la formazione di placche distinte per un conteggio accurato. Permette l'estrapolazione del titolo a partire dalle diluizioni numerabili fino al campione originale.

Quale output quantitativo consente la classificazione della potenza antivirale?

Il conteggio delle placche per pozzetto, convertito in unità formanti placca per millilitro (PFU/mL), fornisce una misura quantitativa della titolazione del virus infettivo. Il confronto tra PFU/mL di campioni trattati e non trattati rivela una riduzione del carico virale indotta dal farmaco.

Perché i requisiti di replicazione sono importanti per la validità del saggio?

Eseguire esperimenti in triplicato garantisce l'affidabilità statistica e tiene conto della variabilità biologica nei campioni di tessuto e nei ceppi virali. Una riduzione costante delle placche tra i replicati rafforza la fiducia nell'efficacia antivirale.

Quale analisi statistica è necessaria prima di interpretare i risultati del saggio delle placche?

Per valutare la variabilità, è necessario calcolare la media e la deviazione standard da conteggi di placche effettuati in triplice replicato. Una riduzione significativa delle PFU/mL rispetto al controllo, generalmente valutata mediante test t o ANOVA, conferma l'effetto antivirale.

Determinazione dell'efficacia antivirale di farmaci sperimentali attraverso un test a placca

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunologia

0 visualizzazioni • 2:48 min • July 8th, 2025

Inizia con un campione contenente virus ottenuto da una cornea suina infetta trattata con un farmaco antivirale.

Eseguire una diluizione seriale del campione per creare una sequenza di concentrazioni di virus decrescenti.

La diluizione ottimale previene l'infezione di una singola cellula da parte di più virus.

Introdurre i campioni diluiti in un monostrato di cellule ospiti e incubare.

Il virus si attacca al recettore della cellula ospite, entra nella cellula e ne avvia la replicazione. La cellula infetta lisi, rilasciando virioni.

Aggiungere la metilcellulosa, una sostanza viscosa che confina i virus nelle cellule vicine.

Successivamente, i virus causano la morte cellulare e la formazione di placche nella regione infetta.

Aggiungi metanolo per fissare le cellule.

Usa il cristallovioletto per colorare le cellule vive.

Osservare le placche come zone chiare che indicano cellule infette e morte cellulare, circondate da cellule non infette colorate di cristallovioletto.

Infine, contare il numero di placche alla massima diluizione per quantificare il titolo virale nella soluzione iniziale per determinare l'efficacia del farmaco antivirale.

Per quantificare la quantità di virus raccolta da ciascuna cornea, preparare una diluizione log₁₀di una volta del virus in terreno privo di siero in provette da microcentrifuga fino a raggiungere una diluizione di 1 x ^10-8.

Dopo aver aspirato il terreno di crescita da ciascun pozzetto di cellule, trasferire 1 millilitro di ciascuna diluizione virale, iniziando da 1 x ^10-3 ai monostrati cellulari placcati, e porre le cellule infette nell'incubatore di coltura cellulare per due ore. Al termine dell'incubazione, lavare delicatamente ogni pozzetto 2 volte con PBS prima di aggiungere 2 millilitri di terreno carico di metilcellulosa a ciascun pozzetto per un'incubazione di 72 ore, o fino a quando non si può osservare la formazione di placche.

Dopo l'osservazione della placca, aggiungere lentamente 1 millilitro di metanolo all'angolo di ciascun pozzetto per un'incubazione di 15 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, aspirare lentamente il contenuto da ciascun pozzetto senza disturbare il monostrato cellulare.

Quindi, etichettare ogni pozzetto con 1 millilitro di soluzione di lavoro in cristallovioletto, facendo attenzione che tutte le cellule siano coperte per un'incubazione di 30 minuti al riparo dalla luce. Al termine dell'incubazione, scartare la soluzione e asciugare i pozzetti su un foglio di carta assorbente. Quindi, contare il numero di placche alla massima diluizione per quantificare il contenuto totale di virus nella soluzione iniziale per 3 volte.