Un test per determinare l'inizio del biofilm polimicrobico su cellule infettate da virus

Prelevare una piastra a più pozzetti contenente monostrati di cellule di mammifero.

Pozzetti per il test dei semi con il virus dell'Herpes simplex. I pozzi di controllo mancano del virus.

Il virus si lega all'eparan solfato della superficie cellulare e viene internalizzato tramite endocitosi.

L'infezione virale innesca la secrezione di eparanasi, che scinde l'eparan solfato e smaschera specifici recettori fungini.

Co-incubare le cellule con le tube germinali di Staphylococcus aureus e Candida albicans.

Nelle cellule infettate da virus, la deplezione dell'eparan solfato inibisce l'interazione batterica promuovendo le interazioni dei recettori fungini, prevenendo la co-localizzazione batterico-fungina.

Nelle cellule di controllo, i batteri interagiscono con l'eparan solfato, mentre i funghi si legano ai recettori disponibili.

Questa co-localizzazione microbica avvia l'aderenza, il primo passo nella formazione del biofilm.

Dopo l'incubazione, rimuovere i microbi non legati. Sovrapporre con un tampone di lisi, rilasciando batteri e funghi nel terreno.

Stendere il lisato cellulare su piastre contenenti terreni di coltura. Incubare per la formazione di colonie.

Una diminuzione delle colonie batteriche con un corrispondente aumento delle colonie fungine indica l'inibizione indotta dal virus della co-localizzazione batterico-fungina e dell'inizio del biofilm.

Per eseguire un saggio del biofilm polimicrobico, seminare piastre a 96 pozzetti con 200 microlitri di 2 volte 10 alla 5a cellula HeLa per millilitro. Agitare le piastre a 37 gradi Celsius per 30-45 minuti, prima di incubare in anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius per 18 ore. Utilizzare 1 volta ottimale per lavare i monostrati. Quindi, semina con un singolo ceppo di HSV. Testare solo una varietà alla volta.

Incubare le piastre a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per tre ore. Utilizzando 100 microlitri di PBS a 37 gradi Celsius con magnesio e calcio, lavare i monostrati infetti. Quindi, utilizzare 37 gradi Celsius HBSS per sostituire il PBS. Lasciare 25 microlitri di HBSS in ogni pozzetto.

Quindi, aggiungere le sospensioni di lavoro GT e/o S. aureus e incubare le piastre a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per 30 minuti. Dopo l'incubazione, aspirare una colonna della piastra alla volta. Riempire immediatamente i pozzetti utilizzando 300 microlitri di PBS con magnesio e calcio.

Dopo aver ripetuto questa fase di lavaggio due volte, aggiungere 200 microlitri a una diluizione da 1 a 50 di tampone di lisi RIPA sterilizzato con filtro in ciascun pozzetto.

Quando si lavora con altri ceppi di batteri o funghi, assicurarsi che la concentrazione di RIPA utilizzata sia sufficiente per la lisi cellulare, ma comunque permissiva per i test di vitalità microbica.

Triturare rapidamente il lisato cellulare HeLa e pipettare 50 microlitri su sali di mannitolo e/o terreno fungicida. Quindi, utilizzando una bacchetta di vetro piegata a un angolo di 90 gradi, stendere il lisato sulla superficie della lastra.

Dopo aver incubato le piastre per 18 ore, contare manualmente il numero di colonie per piastra. I controlli consistono nell'adesione di S. aureus e/o C. albicans alle cellule HeLa non infette da HSV.