JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 2:56 min. • July 8th, 2025
Inizia seminando una coltura batterica in una piastra di analisi. Quindi, incubare la piastra.
Le cellule batteriche hanno adesine superficiali e pili che consentono loro di aderire l'una all'altra, formando piccoli aggregati.
Aggiungere concentrazioni variabili di antibiotico ai pozzetti, lasciandone uno non trattato per un controllo.
Le molecole antibiotiche interagiscono con i batteri sensibili, influenzando la loro capacità di crescere e riprodursi, portandoli alla morte.
I batteri resistenti agli antibiotici rimangono metabolicamente attivi, producendo molecole di ATP.
Usa un sonicatore per distruggere le cellule batteriche, rilasciando il loro contenuto intracellulare, incluso l'ATP.
Aggiungere il reagente glow per l'utilizzo dell'ATP contenente luciferina, enzima luciferasi e altri cofattori.
La luciferasi utilizza l'ATP e l'ossigeno per convertire la luciferina in un'ossiluciferina eccitata.
L'ossiluciferina passa successivamente al suo stato fondamentale, emettendo luce luminescente.
Misurare l'assorbanza utilizzando un lettore di piastre.
La diminuzione dell'assorbanza a concentrazioni più elevate di antibiotici suggerisce una minore produzione di ATP, indicando un ridotto tasso di sopravvivenza batterica.
Misurare la densità ottica a 650 nanometri o OD650 per determinare la concentrazione dei batteri sospesi e regolare la concentrazione di GC a circa 1 x 108 unità formanti colonie per millilitro. Successivamente, aggiungere 99 microlitri di sospensione GC nei singoli pozzetti di una piastra a 96 pozzetti e lasciare che i batteri si aggreghino a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 6 ore.
Al termine dell'incubazione, aggiungere 1 microlitro di ceftriaxone diluito in serie a ciascun pozzetto, lasciando alcuni pozzetti non trattati che fungano da controlli, e rimettere la piastra nell'incubatore per altre 24 ore. Il giorno successivo, sonicare la sospensione in ciascun pozzetto tre volte a 144 watt e 20 kilohertz per 5 secondi per sonicazione e aggiungere 100 microlitri di reagente a bagliore per l'utilizzo di ATP disponibile in commercio a ciascun pozzetto.
Trasferire con cura 150 microlitri di miscela da ciascun pozzetto nei singoli pozzetti di una nuova micropiastra nera a 96 pozzetti e misurare l'assorbanza di ciascun pozzetto a 560 nanometri su un lettore di piastre. Quindi, calcolare il tasso di sopravvivenza in base al rapporto tra la lettura ottenuta dopo un trattamento antibiotico seriale e la lettura dai pozzetti non trattati.