Un test in vitro per valutare l'impatto immunomodulatorio dei monociti sulla proliferazione leucocitaria

Prelevare una piastra a più pozzetti con coltura di cellule staminali mesenchimali aderenti, o MSC.

Aggiungere cellule mononucleate del sangue periferico, o PBMC, e incubare.

Le MSC secernono il fattore di crescita degli epatociti, inducendo i monociti ad acquisire un fenotipo immunomodulatorio, producendo interleuchina-10, o IL-10.

Trasferire il surnatante contenente PBMC in una provetta.

Aggiungere perle magnetiche rivestite di anticorpo che si legano al marcatore di superficie del monocita CD14.

Utilizzare un separatore magnetico per isolare i monociti CD14+ e aggiungerli a pozzetti di piastre multipozzetto in concentrazioni crescenti.

Introdurre le cellule T CD4+ effettrici marcate con CFSE con colorante fluorescente.

Aggiungere microsfere coniugate con anticorpi che si legano specificamente ai marcatori di superficie delle cellule T CD3 e CD28, attivando le cellule.

Nei monociti di controllo ben carenti, le cellule T attivate proliferano, con ogni divisione cellulare che diminuisce l'intensità della fluorescenza CFSE nelle cellule figlie.

Tuttavia, nelle co-colture, i monociti indotti da MSC secernono IL-10, sopprimendo la proliferazione delle cellule T effettrici.

Utilizzando la citometria a flusso, osservare un minor numero di cellule T che mostrano intensità di fluorescenza CFSE ridotte con l'aumento delle concentrazioni di monociti, indicando la soppressione della proliferazione delle cellule T effettrici da parte dei monociti indotti da MSC.

Per eseguire un saggio di soppressione dell'effettore, iniziare impostando una co-coltura MSC-PBMC con 2,5 x 10⁶ PBMC, co-coltivata con 250.000 MSC per garantire un numero sufficiente di PBMC co-coltivate con MSC per la selezione della sottopopolazione.

Dopo 48-72 ore a 37 gradi Celsius, selezionare i leucociti immunomodulatori indotti da MSC di interesse con le perle magnetiche appropriate. Quindi, aggiungere cellule T CD4-positive allogeniche marcate con CFSE in 1 millilitro di terreno leucocitario completo per pozzetto, a vari rapporti sperimentali.

Successivamente, aggiungi microsfere coniugate anti-CD3/28 con un rapporto perlina-cellula 1 a 1 per stimolare le cellule T CD4-positive. Il terzo giorno di co-coltura, valutare la proliferazione delle cellule T CD4-positive marcate con CFSE mediante citometria a flusso.