Un'indagine sul flusso in vitro dell'effetto delle cellule stromali sul reclutamento dei leucociti

Prendiamo le camere di flusso preassemblate collegate a sistemi di flusso con filtri transwell: una con una monocoltura endoteliale sulla parte superiore e l'altra con una coltura endoteliale sulla parte superiore e cellule stromali sul fondo.

Entrambe le camere sono pretrattate con una citochina pro-infiammatoria.

In una monocoltura, le citochine attivano le cellule endoteliali, sovraregolando l'espressione della molecola di adesione.

Tuttavia, il cross-talk tra le cellule stromali ed endoteliali nella co-coltura porta le cellule stromali a produrre mediatori regolatori che riducono la risposta delle cellule endoteliali alle citochine pro-infiammatorie.

Posizionare la camera su un tavolino per microscopio a contrasto di fase invertito.

Introdurre una sospensione di neutrofili.

I neutrofili vengono reclutati e si legano alle molecole di adesione endoteliale tramite interazioni adesive transitorie, facilitando la loro interazione con le chemochine legate alla superficie e rotolando lungo l'endotelio.

Questa interazione attiva le integrine sui neutrofili, stabilizzando l'adesione e provocando la trasmigrazione attraverso le cellule endoteliali.

Tuttavia, nella co-coltura, la risposta endoteliale sottoregolata provoca un reclutamento soppresso dei neutrofili.

Visualizzare le colture al microscopio a contrasto di fase per valutare il reclutamento dei neutrofili dal flusso.

Per il modello con filtro, tagliare prima un pezzo di Parafilm della stessa dimensione del vetrino coprioggetti, utilizzando una dima metallica. Quindi, ritaglia una fessura di 20 x 4 millimetri nel Parafilm usando una sagoma di metallo per creare il canale di flusso. Utilizzare la guarnizione Parafilm per contrassegnare il canale di flusso sul vetrino coprivetro. Allineare i bordi del filtro a sei pozzetti sul vetrino coprioggetti. Assicurarsi che il filtro copra i contrassegni del canale di flusso. Ritagliare con cura il filtro utilizzando un bisturi di tipo 10A.

Quindi, coprire accuratamente il filtro con una guarnizione Parafilm, assicurandosi che la fessura del canale di flusso si trovi al centro del filtro. Usa un pezzo di fazzoletto pulito e spingi fuori eventuali bolle. Ora, posizionare il vetrino coprioggetti nell'incavo della piastra inferiore della camera di flusso in perspex.

Posizionare la piastra superiore in perspex sopra la guarnizione e avvitare le piastre insieme. Ruotare il rubinetto a tre vie per consentire al tampone di lavaggio PBS-A di fluire attraverso la valvola. Quindi, collegare il tubo del manometro alla porta di ingresso della piastra superiore in perspex. Far passare PBS-A attraverso il canale di flusso per consentire il passaggio delle bolle.

Quindi collegare il tubo del manometro dalla pompa a siringa alla porta di uscita della piastra in perspex. Pulire il PBS-A che è gocciolato sulla piastra superiore della camera. Infine, posizionare la camera sul tavolino di un microscopio a contrasto di fase invertito e regolare la messa a fuoco per visualizzare le cellule endoteliali sopra i filtri.

Per perfondere i leucociti sulle cellule endoteliali, impostare la pompa a siringa in modo che si riempia e premere Esegui. Una volta regolata la messa a fuoco per visualizzare il monostrato di cellule endoteliali, inserire due millilitri di neutrofili purificati nel serbatoio del campione e lasciare riscaldare per due minuti. Quindi, lavare l'endotelio con PBS-A per due minuti. Aprire la valvola per perfondere i neutrofili sull'endotelio. Erogare il bolo dei neutrofili per quattro minuti. Chiudere la valvola e perfondere il PBS-A dal serbatoio di lavaggio per il resto dell'esperimento.

Durante l'esecuzione dell'esperimento, assicurarsi che le bolle d'aria non passino in nessun punto durante il test, poiché ciò interromperà il monostrato delle cellule endoteliali e causerà il distacco dei neutrofili aderenti.

Registra il reclutamento dei neutrofili durante il flusso dei neutrofili o la postperfusione utilizzando il software di acquisizione di immagini digitali. Identificare il centro del canale spostando l'obiettivo sul bordo del canale in corrispondenza della porta di ingresso e identificando il centro della porta. Effettuare tutte le registrazioni digitali di almeno 5-10 campi al centro del canale di flusso.

Durante la registrazione durante il flusso di neutrofili, scattare immagini di un singolo campo ogni 10 secondi per un minuto. Spostarsi lungo il canale e registrare un altro campo per un minuto, ripetendo questo processo per tutta la durata del bolo.

Per registrare la postperfusione, effettuare una registrazione di 10 secondi di 5-10 campi lungo il centro del canale di flusso per valutare il comportamento dei leucociti. Scatta immagini ogni secondo entro l'intervallo di 10 secondi. Ciò consente di analizzare il tempo sufficiente per la cattura dal flusso e il comportamento dei neutrofili aderenti.

Registrare un singolo campo contenente almeno 10 neutrofili trasmigrati per cinque minuti, scattando immagini ogni 30 secondi. Questo può essere utilizzato per calcolare la velocità delle celle migrate. Registra un'altra serie di campi di 10 secondi. Ciò consente ai neutrofili di migrare attraverso il monostrato endoteliale.

Infine, arrestare la pompa a siringa e rimuovere il tubo di uscita e quindi il tubo di ingresso. Smontare la camera di flusso e sciacquare il serbatoio del campione con PBS-A. Ripetere per i filtri e i canali di microvetrino successivi prima di procedere all'analisi del reclutamento e del comportamento dei leucociti come descritto nel protocollo di testo.