Un metodo per la preparazione del campione per visualizzare i batteri che formano biofilm sulle ife fungine

Introdurre una colonia fungina legata al cellophane in una sospensione batterica marcata in fluorescenza. Rimuovere il cellophane e incubare.

Le cellule batteriche aderiscono alla superficie fungina attraverso molecole e recettori di superficie. I batteri aderenti secernono sostanze polimeriche extracellulari costituite da polisaccaridi, proteine e DNA, intrappolando le cellule batteriche e formando le fondamenta strutturali del biofilm.

Sciacquare la sezione in una soluzione salina forte per rimuovere i batteri legati in modo lasco

In un tampone fosfato, tagliare una sezione della colonia.

Trasferire la sezione in acqua sterile contenente agglutinina di germe di grano, o WGA legata a un colorante fluorescente rosso.

La WGA, una proteina vegetale, si lega ai residui di N-acetilglucosamina e acido sialico, consentendo al colorante attaccato di emettere fluorescenza sulla parete cellulare fungina.

Sciacquare la sezione in un tampone fosfato.

Immergere parzialmente un vetrino nel tampone. Lascia che la sezione galleggi su di essa. Sollevare delicatamente in modo che la sezione si stabilizzi senza interrompere il biofilm.

Posizionare un mezzo di montaggio, seguito da un vetrino coprioggetti per l'analisi microscopica.

Dopo aver fatto crescere i batteri durante la notte, centrifugare la coltura a 5.000 volte g per tre minuti, quindi sospendere il pellet in 25 millilitri di tampone fosfato di potassio sterile 0,1 molare. Dopo aver ripetuto la centrifugazione, utilizzare lo stesso tampone per regolare la concentrazione batterica finale da 10 a none cellule per millilitro.

Riempire una micropiastra a 6 pozzetti con 5 millilitri di sospensione batterica. Utilizzare una lama di rasoio sterile per tagliare la membrana di cellophane della coltura fungina in quadrati, con una singola colonia su ciascuna membrana. Quindi, con una pinza, rimuovere con cura i quadrati di cellophane contenenti ife dal mezzo solido e trasferirli nei singoli pozzetti della sospensione batterica.

Agitare delicatamente la micropiastra fino a quando le colonie fungine non si staccano dal cellophane. Quindi, rimuovere i fogli di cellophane lasciando le colonie fungine nel piatto. Incubare la micropiastra con leggera agitazione a 20 gradi Celsius per un tempo che dipende dai ceppi utilizzati e dallo stadio da analizzare.

Per P. fluorescens BBc6/L. bicolor, incubare le colture per 30 minuti per ottenere biofilm in fase iniziale e per un massimo di 16 ore per biofilm maturi. Per rimuovere i batteri planctonici e i batteri attaccati elettrostaticamente alle ife, sciacquare il fungo trasferendolo in una nuova micropiastra a 6 pozzetti riempita con una soluzione salina forte. Agitare delicatamente la piastra per 1 minuto.

Trasferire il fungo in una nuova micropiastra a 6 pozzetti contenente 5 millilitri di tampone fosfato di potassio sterile 0,1 molare. Agitare delicatamente la piastra per due minuti, quindi trasferire il fungo in un tampone fresco.

Mantenendo la colonia fungina in buffer, usa un bisturi per tagliare la colonia approssimativamente a metà. Trasferire metà della colonia da colorare in una capsula di Petri contenente 1 millilitro di acqua sterile integrata con un colorante fluorescente appropriato per visualizzare la rete fungina, come l'agglutinina di germe di grano coniugata ad Alexa Fluor633. Quindi, incubare il campione al buio.

Dopo la colorazione, sciacquare il campione trasferendolo in un coperchio di Petri contenente 10 millilitri di tampone fosfato di potassio sterile 0,1 molare e agitare delicatamente per 1 minuto. Immergere a metà un vetrino nel coperchio della capsula di Petri e posizionare delicatamente la sezione tagliata in modo che galleggi sopra il vetrino. Quindi, sollevare lentamente il lato dalla soluzione tampone consentendo al campione di depositarsi delicatamente sul vetrino.

L'aspetto più delicato è il posizionamento del campione sul vetrino. Per evitare l'interruzione del biofilm, il campione e il vetrino devono essere immersi durante il posizionamento del campione e il campione non deve più essere spostato prima dell'imaging.

Infine, aggiungere 10 microlitri di terreno di montaggio anti-sbiadimento al campione e coprirlo con un vetrino coprioggetti.