Analisi in tempo reale della migrazione delle cellule T residenti in diverse regioni tumorali mediante microscopia confocale

0 visualizzazioni4:23 min • July 8th, 2025

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Inizia con una fetta di tumore polmonare contenente cellule T residenti.

Le cellule T migrano attraverso il microambiente tumorale e interagiscono con le cellule tumorali e gli elementi stromali, svolgendo funzioni immunitarie.

La composizione del microambiente tumorale influenza fortemente lo spostamento e la velocità delle cellule T.

Aggiungi anticorpi accoppiati in fluorescenza distinti per marcare le cellule T, le cellule tumorali e gli elementi stromali nel microambiente.

Aggiungere DAPI, che infiltra le cellule con una membrana plasmatica danneggiata per colorare il nucleo, consentendo la visualizzazione delle regioni necrotiche all'interno del tumore.

Osservare il campione colorato al microscopio confocale.

Utilizzando una luce a fluorescenza adatta, selezionare una regione tumorale di interesse contenente cellule T residenti. Valutare la vitalità cellulare valutando le cellule DAPI-positive.

Per l'analisi in tempo reale, è possibile definire gli intervalli di tempo e il tempo totale di registrazione.

Per acquisire immagini z-stack, iniziare a una profondità inferiore alle cellule T etichettate e acquisire immagini a vari intervalli di tempo.

Utilizza il software di tracciamento per confrontare la lunghezza di spostamento delle cellule T e la velocità media in diverse regioni tumorali.

Diluire gli anticorpi marcati in fluorescenza necessari e il colorante nucleare a fluorescenza, DAPI, alle concentrazioni finali richieste in un terreno RPMI privo di rosso fenolo. Quindi, rimuovere la piastra di coltura dall'incubatrice e, utilizzando una punta fine, aspirare il liquido all'interno delle rondelle in acciaio inossidabile.

Ora, senza toccare la fetta, aggiungere 40 microlitri di anticorpi diluiti su ogni fetta del tumore. Per consentire la colorazione, incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Al termine della fase di colorazione, utilizzando una pinza fine, rimuovere le rondelle. Quindi, estrarre delicatamente le fette e immergerle in RPMI1640 medie senza rosso fenolo per 10 secondi. Riposizionare le fette sugli inserti di coltura cellulare e aggiungere una goccia di RPMI1640 di terreno privo di rosso fenolo su ogni fetta. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 10 minuti e poi procedere all'imaging.

Diverse ore prima di iniziare questo esperimento, impostare la temperatura della camera termica del microscopio a 37 gradi Celsius, quindi preparare il microscopio impostato per perfondere costantemente fette tumorali con terreno RPMI ossigenato privo di rosso fenolo e per aspirare la soluzione in un pallone di raccolta dei rifiuti utilizzando una pompa peristaltica.

Con l'aiuto di una pinza fine, sollevare la fetta macchiata dalla piastra a sei pozzetti e trasferirla in un piatto di plastica da 35 millimetri riempito con un mezzo RPMI privo di rosso fenolo, quindi posizionare un'ancora di fetta sopra la fetta per sostenerla. Quindi, posiziona questa capsula di Petri sul tavolino di imaging del microscopio.

Dopo aver collegato le punte di ingresso e di uscita del sistema di perfusione, accendere la pompa peristaltica per consentire al mezzo ossigenato di passare attraverso i tubi di perfusione. Abbassare l'obiettivo a immersione in acqua fino alla fetta e mettere a fuoco la parte superiore della fetta con luce a campo chiaro o con la lunghezza d'onda appropriata.

Quindi, utilizzando filtri appropriati, visualizzare e selezionare una regione di interesse che contiene tutte le cellule di interesse marcate in fluorescenza, vale a dire le cellule T CD8, le isole tumorali e le cellule stromali CD90-positive. Impostare una sessione di imaging utilizzando l'intensità del laser e i tempi di esposizione appropriati per adattarsi alla luminosità dei segnali fluorescenti osservati. Quindi, imposta lo spessore dello stack Z per l'immagine all'interno della fetta tumorale.

Quindi, seleziona l'intervallo di tempo dell'immagine Z-stack e il tempo di registrazione totale per acquisire immagini a intervalli di tempo specifici. Dopo aver acquisito ed esportato le immagini fluorescenti, analizzare la migrazione delle cellule T CD8 come descritto nel protocollo di testo.

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Ultimo aggiornamento: 22 agosto 2026