JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 visualizzazioni • 4:37 min • July 8th, 2025
Trattare colture neuronali con concentrazioni crescenti di una tossina di prova.
La tossina entra nelle cellule e viene rilasciata nel citosol.
A seconda del suo potenziale, la tossina può prevenire la fusione vescicolare, inibendo il rilascio di neurotrasmettitori.
Sostituire il terreno con un tampone contenente composti neurofarmacologici specifici per bloccare i potenziali d'azione neuronali.
Posizionare il piatto di coltura su un tavolino di elettrofisiologia. Per avviare la registrazione, collegare un neurone soma con una pipetta contenente un elettrodo di registrazione.
Applicare una pressione negativa costante per aspirare una piccola porzione della membrana, formando un gigaseal, una tenuta ermetica che garantisce un'interferenza minima durante la registrazione.
Mantenere una tensione di membrana costante per misurare le correnti neuronali.
Applicare impulsi di pressione negativa per rompere la membrana, stabilendo un contatto diretto tra il neurone e la pipetta.
Registra le correnti prodotte nel neurone a causa dell'assorbimento di neurotrasmettitori, chiamati mEPSC.
Una diminuzione della frequenza di mEPSC con l'aumento dell'esposizione alle tossine indica l'inibizione del rilascio di neurotrasmettitori.
Diluire la neurotossina botulinica sierotipo A a 100 volte la concentrazione finale desiderata nel terreno di coltura ESN e riscaldare a 37 gradi Celsius. Quindi, aggiungere un volume appropriato di tossina alle colture ESN DIV 21+. Agita il piatto di coltura e torna all'incubatrice.
Al momento desiderato, aspirare il terreno di coltura ESN e lavare due volte con tampone di registrazione extracellulare o ERB. Quindi, aggiungere 4 millilitri di ERB integrati con 5 tetrodotossina micromolare per bloccare i potenziali d'azione e 10 bicucullina micromolare per antagonizzare l'attività del recettore GABAA. Quindi, trasferire la parabola sul rig di elettrofisiologia. Non è richiesta né la perfusione né il controllo della temperatura per l'inibizione misurata della trasmissione sinaptica o del test MIST.
Dopo aver utilizzato un estrattore per micropipette per estrarre pipette in borosilicato con resistenza da 5 a 10 megaohm, riempire nuovamente una pipetta con un tampone di registrazione intracellulare. Quindi, immergere delicatamente la pipetta nel reagente siliconificante. Fissare la pipetta di registrazione al supporto dell'elettrodo e collegare una siringa piena d'aria al tubo che viene inserito nel supporto dell'elettrodo. Fornire una pressione positiva costante attraverso la siringa mentre si abbassa la pipetta di registrazione nell'ERB.
Dopo aver fatto atterrare delicatamente la pipetta di registrazione sul soma del neurone da registrare, afferrare la pressione positiva rompendo il sigillo sulla siringa. Ricollegare la siringa e applicare una pressione negativa sostenuta attraverso una delicata inspirazione per formare una tenuta gigaohm. Una volta formata la guarnizione gigaohm, diminuire la tensione di mantenimento a meno 70 millivolt, quindi applicare con cautela brevi impulsi di pressione negativa utilizzando la siringa per passare alla configurazione all'ingrosso.
Monitorare i picchi di capacità per 30 secondi per verificare che la patch sia stabile. Annulla i picchi di capacità nel software hacker e passa alla modalità pinza di corrente per monitorare e registrare il potenziale della membrana a riposo. Senza aggiustamento per i potenziali di giunzione liquida, il potenziale di membrana a riposo dovrebbe essere compreso tra meno 67 e meno 82 millivolt.
Regolare il guadagno a 2 millivolt per picoamp. Passa alla modalità voltage-clamp ed esegui una registrazione continua di meno 70 millivolt, registrando da 3 a 5 minuti per rilevare correnti postsinaptiche eccitatorie in miniatura.
Analizza da 3 a 5 minuti di dati registrati per rilevare i MEPSC utilizzando le impostazioni predefinite per gli EPSC del recettore AMPA nella mini-analisi. Raccogli e salva informazioni sugli eventi rilevati. Dopo aver raccolto le frequenze mEPSC per 8-12 controlli e da 8 a 12 campioni trattati con neurotossina botulinica per ciascuna condizione di esposizione, analizzare la frequenza rispetto all'età e ai controlli abbinati per lotto.