Name: Organotipiche Collagene I test: una piattaforma malleabile per valutare Comportamento cella in un 3-dimensionale Contesto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Scopri come creare matrici di collagene tridimensionali con fibroblasti umani per studiare la migrazione cellulare e l'invasione tumorale. Questo metodo organotipico replica lo stroma tissutale per analisi microscopiche avanzate.

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1. Istituzione di colture di fibroblasti da espianti di pelle <ol><li> 4 biopsie millimetri punzone acquisiti da avambraccio umano sono posti in MEM addizionato 100 unità / ml di penicillina, 100 ug / ml streptomicina, e 0,25 mcg / ml Fungizone. </li><li> Tagliare il grasso sottocutaneo e tritare finemente la biopsia in piccoli pezzi da dondolo 24 lama di bisturi numero contro il fondo della capsula di Petri. </li><li> Tessuto slurry posto in un centimetro 25 2 pallone di coltura tissutale con mezzi primari di crescita dei fibroblasti (MEM supplementato con 10% FCS, 100 unità / ml di penicillina, 100 ug / ml streptomicina, e 25 ug / ml Fungizone) aggiunto finché la superficie del pallone è coperto ma la profondità del liquido è insufficiente per il tessuto a stare a galla. </li><li> Seguendo tre giorni di incubazione a 37 ° C in atmosfera umidificata al 5% di CO 2, aggiungere 3 ml di mezzo di crescita dei fibroblasti primari. </li><li> Dopo un altro giorno 3 Media cambiamento di incubazione con i media fibroblasti primari di crescita fresche, o se cells sono quasi confluenti possono essere suddivisi 01:04 in mezzi freschi. (Fungizone può essere omesso da questo punto in poi). </li></ol> 2. Fase I - Preparazione del collagene I di code di ratto Nota: protocollo per circa 12-14 code di ratto adolescente (freschi o surgelati) <ol><li> Preparare coda di ratto mediante lavaggio in 70% etanolo e rimuovere tendini come segue: </li><li> Rimuovere la pelle dal coda di ratto mediante tranciatura nel mezzo della coda da cima a fondo con un bisturi e pealing lungo la lunghezza della coda. </li><li> Tendine staccare dal nucleo della regione prossimale della coda. </li><li> Rimuovere tendine verso la regione distale della coda evitando la guaina con pinze dentate. </li><li> 1 g di estratto tendine / 250 ml di 0,5 M di acido acetico agitazione a 4 ° C per 48 h. </li><li> Centrifugare l'estratto (7.500 xg) per 30 minuti e scartare il pellet. </li><li> Aggiungere un volume uguale del 10% (w / v) NaCl al supernatante, e agitare per 30-60 min. </li><lcentrifugare i xg per minuti scartare il surnatante e ri-sciogliere precipitato in m di acido acetico rapporto da agitazione ore a c.><li> Dializza la soluzione di collagene contro 6-8 cambi di 6L ~ 17,5 mM di acido acetico (1 ml di acido acetico glaciale per litro di acqua fredda, modifica 2 x al giorno). </li><li> Centrifugare collagene dializzato a 30.000 xg per 1,5 ore. </li><li> Rimuovere il surnatante e mettere in beuta sterile. </li><li> Regolare la concentrazione di collagene I ~ 2 mg / ml usando acido acetico 0,5 mM a 4 ° C. </li></lcentrifugare></ol> 3. Fase II - Creare la matrice 3D con fibroblasti incorporati consentono di contrarre (per 8 giorni). <ol><li> Assemblare il mix utilizzando reagenti freddi a 4 ° C in un pre-refrigerati bottiglia. I collagen mantenere in ghiaccio. </li><li> Per una T75 pallone confluenti fibroblasti primari (~ cella numero 1 x 10 6) uso: <ul><li> 25 ml di collagene coda di ratto (ca. conc 2mg/ml) </li><li> 3 ml 10xMEM </li><li> 0,22 M di NaOH: in primo luogo, aggiungere 2 ml, poi goccia a goccia sotto agitazione, fino a quando il collagene diventa arancione, </li><li> ma non rosa (solitamente fino a 3 ml). Approssimativo p H = 7.2. </li><li> Nota: è importante garantire che il mezzo / gel rimane neutro o leggermente acido come fibroblasti non contrarre il gel se esposto a condizioni anche leggermente alcaline. </li></ul></li><li> Trypsinise i fibroblasti, centrifugare a 400 xg per 5 minuti e rimuovere il surnatante. </li><li> Durante la centrifuga ad oltre 5 minuti: Preparare 12 x 35 piatti di plastica mm - consegue normalmente 12 piatti da un pallone di fibroblasti / mix collagene. </li><li> Risospendere fibroblasti in 3 ml di FCS e aggiungere immediatamente alla miscela di collagene e mescolare. </li><li> Piastra di circa 2,5 ml di collagene / fibroblasti a piatto più rapidamente possibile. Cercate di evitare le bolle e le impostazioni di collagene. </li><li> Lasciare che il collagene impostato a 37 ° C in atmosfera umidificata al 5% di CO 2 in aria per 10 minuti. </li><li> Aggiungere 1 ml di fibroblasti crescere° media (DMEM + 10% FCS). </li><li> Staccare il collagene / fibroblasti matrice dai lati del piatto con una pipetta. </li><li> Il giorno dopo: Aggiungere 1 ml di terreni di crescita dei fibroblasti (DMEM + 10% FCS). </li><li> Cambiare i media ogni due giorni. Consenti collagene / fibroblasti matrice a contrarre per circa 8 giorni, fino a quando si inseriscono in un piatto da 24 pozzetti (Contrazione da ~ 3,5 cm a 1,5 cm di diametro, si veda la Figura 1). </li></ol> Nota: La concentrazione di collagene deve essere regolata secondo l'applicazione. Il più diluire la soluzione di collagene, più veloce sarà contratto dai fibroblasti. Leggere differenze di velocità di contrazione sarà sperimentato con differenti lotti di collagene alla stessa concentrazione. Allo stesso modo, diverse colture di fibroblasti di contrarre il gel di collagene a ritmi diversi, i fibroblasti e più presenti, più veloce è il tasso di contrazione. Concentrazione di collagene e densità dei fibroblasti possono quindi, regolato per modificare la velocità di contrazione,e la densità finale del gel di collagene. 4. Fase II - cellule Placcatura di interesse sulla parte superiore della matrice Nota: Sterilizzare tutti pinze e le attrezzature con etanolo prima dell'uso. <ol><li> Utilizzando pinze smussato, spostare delicatamente matrice contratto a 24-ben piatto. Assicurarsi che non si piega. </li><li> Preparare la sospensione di cellule di interesse a circa 4 x 10 1 ml 4 / ml e la piastra (dopo che le cellule trypsinising, di selezione per sbarazzarsi di tripsina) sulla parte superiore della matrice. Numero effettivo di cellule necessarie varierà a seconda del tipo cellulare utilizzato. Medie cellulare dovrebbe essere medio normale crescita per le cellule di interesse. </li><li> Permettere alle cellule di crescere fino a confluenza in cima alla matrice, circa 3-5 giorni. </li></ol> 5. Fase III - Trasferire la matrice di una griglia per l'invasione (circa 0-21 giorni) <ol><li> Tagliare griglie in acciaio inox per creare un treppiede e sterilizzare in autoclave prima dell'uso (vedere la figura 2). </li><li> Mettere in rete sterilePiatto 6 cm, aggiungere mezzi di crescita ad un livello sopra la griglia (circa 10.5ml). Matrix posto sulla griglia e delicatamente aspirare supporti modo che il fondo della matrice è in contatto con i media ma non sommersa. Questo è indicato come l'aria / interfaccia liquido, che crea un gradiente che promuove invasione. Sostituire media ogni due giorni (vedi figura 2). </li><li> Vivo delle cellule, l'imaging contestuale utilizzando cellule fluorescenti possono essere esposte in questa fase o precedenti. Il collagene contratto o fibrillare che è possibile creare immagini utilizzando generazione di seconda armonica (SHG, vedi figura 3). Utilizzo multi-fotone di eccitazione combinata con ampio campo di rilevamento si trova che SHG possono essere esposte ad almeno 100 micron nella matrice, mentre le cellule che esprimono GFP citoplasmatica è possibile creare immagini di almeno 200 micron di profondità. </li></ol> Nota: Per quanto riguarda la quantificazione di invasione, il giorno in cui sono posti da matrici sulle griglie definisce Giorno 0. Posizionamento su griglie genera un gradiente di terreni di coltura delle cellule che promuove int invasione o la matrice. I campioni possono essere ripreso nei prossimi 1-21 giorni (o più) la valutazione dei processi biologici come l'invasione, la proliferazione, la sopravvivenza o la differenziazione (Vedi tabella). 6. Fase IV - Fissazione <ol><li> Aggiungere 5 ml del 4% PFA in un tubo Falcon. </li><li> Trasferire la matrice su una superficie piana. Tagliare la matrice a metà con un fresco pulito bisturi (come si sarà colorazione la sezione trasversale), sollevare la matrice con bisturi e trasferimento al 4% PFA, fissare per tutta la notte. </li><li> Matrici organotipiche sono ora pronti a macchiare con l'anticorpo / macchia di scelta (vedi Figura 3). </li></ol> 7. Rappresentante dei risultati: <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3089/3089fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 Esempio di fibroblasti-contratto Miscela collagene I. fibroblasti collagene e della coda di ratto staccato dalla capsula di Petri e ha permesso di contrarre più di 6-8 giorni. Figura 2 "src =" / files/ftp_upload/3089/3089fig2.jpg "/&gt; Figura 2 progressione organotipica dosaggio. A, schematica di set up organotipica e progressione. B, Esempio di collagene / fibroblasti matrice sopra di acciaio inossidabile, griglia sterile per creare interfaccia aria / liquido. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3089/3089fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3 Applicazioni di test organotipica. A, B non invasive e invasive pancreatiche duttali adenocarcinoma (PDAC) invade le cellule nel tempo con matrice organotipica. C, vita equivalente della pelle che mostra una epidermide stratificata su un fibroblasto-contratto componente collagene dermico. D, C8161 cellule di melanoma che invadono per un fibroblasto -contratto collagene dermico equivalente. E, invasive cellule PDAC (verde) che interagiscono e invadere con fibroblasti (rosso) all'interno della matrice organotipica. F

<ol><li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130, 601-610 (2007).</li>
<li>Edward, M., Gillan, C., Micha, D., Tammi, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+regulation+of+fibroblast+hyaluronan+expression%3A+a+mechanism+to+facilitate+tumour+growth+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Tumour regulation of fibroblast hyaluronan expression: a mechanism to facilitate tumour growth and invasion.</a> Carcinogenesis. 26, 1215-1223 (2005).</li>
<li>Patsialou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+human+breast+cancer+cells+in+vivo+requires+both+paracrine+and+autocrine+loops+involving+the+colony-stimulating+factor-1+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Invasion of human breast cancer cells in vivo requires both paracrine and autocrine loops involving the colony-stimulating factor-1 receptor.</a> Cancer Res. 69, 9498-9506 (2009).</li>
<li>Serrels, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+study+of+E-cadherin+and+membrane+dynamics+in+living+animals%3A+implications+for+disease+modeling+and+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time study of E-cadherin and membrane dynamics in living animals: implications for disease modeling and drug development.</a> Cancer Res. 69, 2714-2719 (2009).</li>
<li>Timpson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Regulation+of+RhoA+Activity+during+Pancreatic+Cancer+Cell+Invasion+Driven+by+Mutant+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial Regulation of RhoA Activity during Pancreatic Cancer Cell Invasion Driven by Mutant p53.</a> Cancer Res. 71, 747-757 (2011).</li>
<li>Edward, M., Quinn, J. A., Pasonen-Seppanen, S. M., McCann, B. A., Tammi, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Methylumbelliferone+inhibits+tumour+cell+growth+and+the+activation+of+stromal+hyaluronan+synthesis+by+melanoma+cell-derived+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">4-Methylumbelliferone inhibits tumour cell growth and the activation of stromal hyaluronan synthesis by melanoma cell-derived factors.</a> Br. J. Dermatol. 162, 1224-1232 (2010).</li>
<li>Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+differentiation+characteristics+of+transformed+keratinocytes+from+mouse+and+human+skin+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Growth and differentiation characteristics of transformed keratinocytes from mouse and human skin in vitro and in vivo.</a> J. Invest. Dermatol. 81, 168s-175s (1983).</li>
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<li>Sabeh, F., Shimizu-Hirota, R., Weiss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease-dependent+versus+-independent+cancer+cell+invasion+programs%3A+three-dimensional+amoeboid+movement+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protease-dependent versus -independent cancer cell invasion programs: three-dimensional amoeboid movement revisited.</a> J. Cell. Biol. 185, 11-19 (2009).</li>
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<li>Gaggioli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast-led+collective+invasion+of+carcinoma+cells+with+differing+roles+for+RhoGTPases+in+leading+and+following+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells.</a> Nat. Cell. Biol. 9, 1392-1400 (2007).</li>
</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Presentiamo qui un metodo per la produzione di una matrice 3-dimensionale adatto per studi di migrazione cellulare invasiva 6-8. La matrice è costituita da collagene di tipo 1 fibrille in subappalto per un periodo di diversi giorni da fibroblasti umani primari epidermiche. Il collagene è preparato mediante estrazione acida non, digestione enzimatica, che conserva reattività alle poli-peptide estremità e promuove reticolazione delle fibrille di collagene in grandi aggregati upon neutralizzazione di condizioni del tampone 9. Ciò comporta una ricostituito gel che più strettamente simula le funzioni di collagene in vivo e ha conseguenze importanti per le proprietà invasive delle cellule coltivate in gel. Non importa se fresco o congelato materiale di partenza viene utilizzato, ma l&#39;uso di code di ratto adolescenti è importante perché il collagene cross-linking è più labile in animali più giovani. Collagene I da animali più giovani è quindi più facile da estrarre, e ri-costituisce with alta fedeltà. La matrice di collagene può essere fissate e colorate con anticorpi diretti contro sia cellule tumorali invasive o fibroblasti stromali 2,10 e sono molto utili per testare l&#39;efficacia dei farmaci che possono inibire l&#39;invasione 5,6. Sebbene questo protocollo suggerisce l&#39;uso di fibroblasti umani primari, è possibile utilizzare fibroblasti primari da altri tipi di tessuto, a seconda del tipo di tessuto in esame. È anche possibile stabilire culture utilizzando fibroblasti immortalizzate, comprese le cellule che sono state stabilmente trasfettate con coniugati proteina fluorescente. In questo modo le cellule stromali e sia tumore può essere etichettato per visualizzare interazioni cellulari durante invasione 11.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> MEM 10x </td><td> Gibco </td><td> 21430 </td><td> - </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma </td><td> 367176-500G </td><td> Preparare magazzino 0,22 M in acqua </td></tr><tr><td> FCS </td><td> PAA Laboratories </td><td> A15-101 </td><td> - </td></tr><tr><td> Piastre da 35 mm </td><td> Falco </td><td> 353001 </td><td> Per il punto 3.4 </td></tr><tr><td> 60 piatti millimetri </td><td> Falco </td><td> 353004 </td><td> Per il punto 5.2 </td></tr><tr><td> Primavera pinza smussato </td><td> Samco </td><td> E003/02 </td><td> Dentata, non è liscia </td></tr><tr><td> 16% paraformaldeide </td><td> Servizi di Microscopia Elettronica </td><td> 15710 </td><td> Diluire al 4% in PBS prima dell&#39;uso </td></tr><tr><td> Schermi per cd-1, taglia 40 maglie </td><td> Sigma </td><td> S07707-5EA </td><td> Griglie in acciaio inox, 5 per confezione </td></tr><tr><td> Dialisi tubo </td><td> Medicell internazionale </td><td> 7607 2295 </td><td> 12-14 kD </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Oxoid </td><td> BR0014G </td><td> - </td></tr><tr><td> Acido acetico </td><td> Sigma </td><td> 242853 </td><td> - </td></tr><tr><td> 24 piatto ben </td><td> Falco </td><td> 353047 </td><td> Per Passaggio 4.1 </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> In vitrogen </td><td> 15290018 </td><td> - </td></tr></tbody></table>

organotipiche collagene i test: una piattaforma malleabile per valutare comportamento cella in un 3-dimensionale contesto

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Migrazione cellulare è fondamentale per molti aspetti della biologia, compreso lo sviluppo, la guarigione delle ferite, le risposte cellulari del sistema immunitario, e metastasi delle cellule tumorali. La migrazione è stata studiata su vetrini in modo da rendere dinamiche cellulari suscettibili di indagine al microscopio ottico. Tuttavia, è diventato chiaro che molti aspetti della migrazione cellulare dipendono caratteristiche dell&#39;ambiente locale compresa la sua elasticità, composizione proteica, e la dimensione dei pori, che non sono fedelmente rappresentati da due substrati rigidi dimensionali quali vetro e plastica 1. Inoltre, l&#39;interazione con altri tipi di cellule, inclusi i fibroblasti stromali e cellule immunitarie 2, 3 ha dimostrato di giocare un ruolo critico nel promuovere l&#39;invasione delle cellule tumorali. Indagine a livello molecolare ha sempre dimostrato che dinamica molecolare, compresa la risposta al trattamento farmacologico, di cellule identiche sono significativamente differenti rispetto <em&gt; In vitro e in vivo 4. Idealmente, sarebbe meglio studiare la migrazione cellulare nel suo contesto naturale in organismi viventi, tuttavia questo non è sempre possibile. Intermedi sistemi di coltura di tessuti, come matrice cellulare derivata, Matrigel, coltura organotipica (descritto qui) espianti tissutali, organoidi, xenotrapianti, e sono quindi importanti intermedi sperimentali. Questi aspetti approssimativi sistemi certi di un ambiente in vivo, ma sono più suscettibili di manipolazione sperimentale come l&#39;uso di linee cellulari stabilmente trasfettate, regimi di trattamento farmacologico, a lungo termine e ad alta risoluzione delle immagini. Tali sistemi intermedi sono particolarmente utili come terreni di prova per convalidare le sonde e stabilire i parametri necessari per l&#39;immagine della risposta dinamica di cellule fluorescenti e giornalisti, prima di effettuare l&#39;imaging in vivo 5. Come tali, essi possono svolgere un ruolo importante nel ridurre la necessità di esperimenti su living animali.

Un metodo è descritto per la preparazione di un 3-dimensionale matrice costituita da collagene di tipo I e di fibroblasti umani primari. Questo gel organotipica serve come substrato utile per valutare la migrazione delle cellule invasive perché imita caratteristiche di base di stroma tissutale ed è suscettibile di molte forme di microscopia.

Organotipiche Collagene I test: una piattaforma malleabile per valutare Comportamento cella in un 3-dimensionale Contesto

La migrazione cellulare è fondamentale per molti aspetti della biologia, tra cui lo sviluppo, la guarigione delle ferite, le risposte cellulari del sistema immunitario e...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di creare una matrice tridimensionale di collagene simile a un tessuto per lo studio della funzione cellulare. Questo risultato si ottiene innanzitutto estraendo il collagene dai tendini della coda del ratto. Successivamente, le fibre di collagene vengono riconstitute in presenza di fibroblasti, consentendo ai fibroblasti di contrarre il gel di collagene.Nel terzo passaggio, le cellule tumorali vengono posizionate sulla sommit&agrave; della matrice nell'ultimo passaggio. La matrice viene incubata sopra una griglia metallica per creare un'interfaccia aria-liquido che permetta l'invadenza delle cellule tumorali all'interno della matrice. Infine, possono essere eseguite colorazioni immunoistochimiche e microscopia a fluorescenza per analizzare la sintesi della matrice, la migrazione cellulare, inclusa l'invadenza delle cellule tumorali e le interazioni tra diversi tipi cellulari.Pertanto, questo metodo è particolarmente adatto per studiare l'invasione e la metastasi, nonché lo sviluppo tumorale. Su un substrato tridimensionale complesso, possiamo analizzare aspetti come la differenziazione, la sopravvivenza cellulare e la crescita cellulare. Ma soprattutto, possiamo esaminare come le cellule tumorali interagiscono con lo stroma durante eventi chiave dell'invasione.Una delle prime fasi della metastasi tumorale consiste nell'ottenere colture di fibroblasti da impianti di pelle. Versare dapprima alcune gocce di MEM integrato con penicillina, streptomicina e fungizone sul fondo di una piastra di Petri. Successivamente, posizionare nell'apposita piastra biopsie ottenute con punch di quattro millimetri, prelevate dall'avambraccio umano.Successivamente, infine, tritare la biopsia in piccoli pezzi muovendo avanti e indietro una lama di bisturi numero 24 contro il fondo della piastra di Petri. Collocare la sospensione di tessuto in un’ampolla da coltura tissutale da 25 centimetri quadrati. Quindi versare il terreno di crescita per fibroblasti primari sul tessuto.Questo quantitativo è sufficiente per coprire la superficie della fiasca, ma insufficiente per far galleggiare il tessuto. Incubare la fiasca per tre giorni a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata di 5%CO2, quindi aggiungere tre millilitri di mezzo di crescita primario per fibroblasti dopo altri tre giorni di incubazione. Sostituire il mezzo con mezzo di crescita primario per fibroblasti fresco.Se le cellule sono quasi confluenti, possono essere suddivise in un rapporto da uno a quattro in nuovi flaconi con mezzo fresco. Iniziare lavando le code dei ratti nell'etanolo al 70%, quindi raffreddare una bottiglia di acido acetico 0,5 M a quattro gradi Celsius per rimuovere i tendini dalle code dei ratti. Per prima cosa, rimuovere la pelle da ciascuna coda di ratto.Successivamente, staccare il tendine dalla parte centrale della regione prossimale della coda. Infine, rimuovere il tendine in direzione della regione distale della coda utilizzando pinze da dentista. Dopo aver rimosso i tendini, aggiungere 250 millilitri di acido acetico 0,5 molare in un matraccio conico di vetro.Estrarre un grammo di tendine ogni 250 millilitri di acido mescolando a quattro gradi Celsius per 48 ore dopo l'estrazione del tendine. Centrifugare la soluzione di acido e tendine a 7.500 ×g per 30 minuti a quattro gradi Celsius, quindi scartare il pellet. Successivamente, aggiungere un volume uguale di NaCl al 10% peso/volume al soprannatante e mescolare per ulteriori 30-60 minuti dopo il secondo passaggio di agitazione.Centrifugare la soluzione. Questa volta a 10.000 × g, eliminare il soprannatante e ri-sciogliere il precipitato in acido acetico 0,25 molare con ulteriore agitazione per 24 ore a quattro gradi Celsius. Successivamente, dializzare la soluzione di collagene contro sei-otto cambi di sei litri di acido acetico circa 17,5 millimolare.Dopo la dialisi, centrifugare il pellet di collagene a 30.000 ×g per 1,5 ore. Infine, trasferire il sopranatante in una bottiglia sterile e aggiustare la concentrazione di collagene a circa due milligrammi per millilitro con acido acetico 0,5 millimolare precedentemente raffreddato, quindi mantenere il collagene in ghiaccio. Per prima cosa, selezionare tre fiasche T75 con fibroblasti primari confluenti.Posizionare un contenitore di siero fetale bovino a quattro gradi Celsius per raffreddarlo. Successivamente, aggiungere 75 millilitri di collagene di coda di ratto precedentemente preparato in una bottiglia sterile di vetro da 100 millilitri, già pre-rafreddata. Quindi aggiungere nove millilitri di 10 XMEM mescolando la miscela.Aggiungere sei millilitri di idrossido di sodio 0,22 normale, rallentando man mano che si avvicina all'ultimo millilitro. Per assicurare che il colore finale sia compreso tra l'arancione e il rosa. Trasferire gli occhi in tripsina e quindi centrifugare le cellule a 400 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente.Durante la centrifugazione, preparare 36 piastre di plastica da 35 millimetri. Risospendere il pellet in 10 millilitri di FCS preraffreddato e aggiungere immediatamente i fibroblasti al collagene. Mescolare e distribuire rapidamente circa 2,5 millilitri della miscela di collagene e fibroblasti per ogni piastra da 35 millimetri.Evitare la formazione di bolle e il consolidamento del collagene. Posizionare le piastre nell'incubatore per 10 minuti in modo che il collagene formi un gel morbido, quindi aggiungere un millilitro di mezzo di crescita per fibroblasti in ogni piastra. Successivamente, staccare la matrice di collagene dai bordi della piastra utilizzando una pipetta e rimettere le piastre nell'incubatore.Il giorno successivo, aggiungere un altro millilitro di terreno di crescita Fiberblast alle piastre. Quindi cambiare il terreno ogni due giorni per circa gli otto giorni successivi. Durante questo periodo, ogni matrice di fibroblasti in collagene dovrebbe contrarsi da circa 3,5 centimetri a circa 1,5 centimetri di diametro. Prima di iniziare il passaggio successivo, sterilizzare tutte le pinzette e l'equipaggiamento con etanolo.Quindi, utilizzando pinze sterili a punta larga, spostare delicatamente una matrice contratta in una pozzetta di una piastra a 24 pozzetti, assicurandosi che la matrice non si pieghi. Successivamente, selezionare un flacone di cellule da analizzare, staccare le cellule con tripchine e centrifugare le cellule come in precedenza; quindi risospendere le cellule nel mezzo e piastrare un millilitro della sospensione cellulare sulla sommità della matrice, quindi posizionare la matrice contratta nell'incubatore fino a quando le cellule non saranno cresciute quasi a confluenza sulla superficie della matrice. Circa da tre a cinque giorni dopo la sterilizzazione in autoclave, preparare in anticipo griglie in acciaio inossidabile tagliate su misura per la creazione di treppiedi prima dell'uso; posizionare una griglia sterile in una piastra di plastica da sei centimetri e aggiungere una quantità sufficiente di mezzo di crescita per coprire la griglia.La creazione dell'interfaccia aria-liquido è la parte più delicata di questa procedura. La matrice deve essere posizionata sulla griglia e quindi il mezzo deve essere aspirato con delicatezza in modo che la matrice rimanga parzialmente immersa dal basso e venga alimentata dal basso. Questo crea un gradiente chemiotattico e permette alle cellule poste in superficie di iniziare a invadere la matrice.Il comportamento delle cellule in questo sistema può quindi essere valutato per 21 giorni o più. Posizionare una matrice sulla griglia. Successivamente, aspirare delicatamente il mezzo fino a quando la parte inferiore della matrice è a contatto con il mezzo, ma non ricoperta da esso.L'interfaccia aria-liquido dovrebbe quindi apparire simile a quella mostrata in questa scena. Successivamente, trasferire una matrice infiltrata su una superficie piana. Tagliare la matrice a metà con un bisturi nuovo e quindi sollevarla con il bisturi e trasferirla in PFA al 4%.Fissare la matrice durante la notte a temperatura ambiente. Nelle seguenti due figure, cellule di adenocarcinoma duttale pancreatico o cellule P DAC sono state stratificate su una matrice organotipica. Nella prima figura, si possono osservare cellule P dac non invasive disposte in uno strato sulla superficie della matrice, mentre nella seconda figura si osservano cellule P dac invasive che hanno infiltrato la matrice. Qui è possibile vedere un equivalente cutaneo vivente che mostra un'epidermide stratificata su un componente dermico contratto da fibroblasti e costituito da collagene. Cellule PD invasive in verde sono visibili in interazione con fibroblasti in rosso, che promuovono l'invasione delle cellule PDX nella matrice organotipica.Le cellule PD invasive mostrate qui in verde sono visualizzate all'interno della matrice di collagene, che viene immaginata mediante generazione di armonica secondaria e mostrata in viola; i siti di degradazione della matrice appaiono come fori scuri all'interno della matrice viola. In questa figura sono mostrate cellule di melanoma C8161 in fase di invasione in un equivalente dermico contratto da fibroblasti; oltre a osservare il comportamento di processi fondamentali di proteine fluorescenti durante questo saggio, è possibile utilizzare questo approccio insieme a una colorazione immunohistochimica per analizzare marcatori di proliferazione cellulare e differenze nella sopravvivenza cellulare, eccetera.

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