JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 4:50 min. • January 15th, 2026
Inizia con una provetta contenente neutrofili. Aggiungere un tampone contenente un inibitore della proteinasi per prevenire la degradazione delle proteine.
Aggiungere un detergente adatto per permeabilizzare la membrana neutrofila
In un bagno di ghiaccio, sonicare il campione con onde sonore ad alta frequenza per interrompere la membrana cellulare, rilasciando contenuti intracellulari, comprese varie proteine.
Centrifugare brevemente per raccogliere il contenuto dalle pareti della provetta e trasferirlo in una provetta adatta.
Introdurre un agente riducente e incubare ad alta temperatura per promuovere la scissione del legame disolfuro, provocando la denatura delle proteine.
Raffreddare e introdurre un reagente alchilante che alchilizza i gruppi sulfidrilici.
Aggiungere acetone freddo per indurre la precipitazione delle proteine.
Centrifuga per pellettare le proteine e i frammenti cellulari. Rimuovere il surnatante e asciugare all'aria.
Introdurre un tampone contenente agente denaturante e sonicare per risolubilizzare il pellet proteico.
Infine, aggiungi una miscela di proteasi che scinde le proteine. Conservare il campione per un'ulteriore elaborazione.
Per iniziare, raccogliere le cellule HL60 differenziate con neutrofili in una provetta da 15 millilitri centrifugando i campioni a 400 volte g per 5 minuti.
Lavare due volte il pellet cellulare aggiungendo 15 millilitri di PBS e centrifugare nuovamente a 400 volte g per 5 minuti.
Aggiungere a ciascun campione 300 microlitri di Tris HCl pH 8,5 da 100 millimolari ghiacciato contenente una compressa di cocktail di inibitori della proteinasi e farli roteare brevemente.
Quindi, aggiungere un volume 1 per 10 di SDS al 20% a una concentrazione finale del 2% e sonicare i campioni in un bagno di ghiaccio per 30 secondi acceso e 30 secondi spento, per cinque cicli al 10% di potenza.
Per raccogliere lo spruzzo dalle pareti del tubo, centrifugare i campioni alla massima velocità per 5-10 secondi, evitando che i detriti cellulari formino un pellet.
Trasferire i campioni dalla provetta da 15 millilitri in una provetta da 2 millilitri e aggiungere 1 per 100 volume di ditiotreitolo stock molare a una concentrazione finale di 10 millimolari.
Dopo un breve vortice, incubare i campioni a 95 gradi Celsius per 10 minuti agitando a 800 giri/min. Quindi, raffreddare i campioni a temperatura ambiente mettendoli sul ghiaccio.
Successivamente, in condizioni di oscurità, aggiungere un volume 1 per 10 di iodoacetammide molare 0,55 a una concentrazione finale di 55 millimolari e agitare la provetta prima di incubare a temperatura ambiente al buio per 20 minuti.
Al termine dell'incubazione, aggiungere il 100% di acetone ghiacciato a una concentrazione finale dell'80%. Conservare i campioni a meno 20 gradi Celsius durante la notte. Conservali per un massimo di due settimane per un uso successivo.
Il giorno seguente, centrifugare i campioni a 13.500 giri/min per 10 minuti a 4 gradi Celsius per far precipitare il pellet della cella. Lavare due volte il pellet della cella aggiungendo 500 microlitri di acetone ghiacciato all'80%, seguito da centrifugazione per 10 minuti a 13.500 giri/min e 4 gradi Celsius.
Al pellet cellulare essiccato all'aria, aggiungere 100 microlitri di urea molare 8 in HEPES da 40 millimolari e sonicare in acqua in un bagno d'acqua a 4 gradi Celsius per 30 secondi di accensione e 30 secondi di spegnimento per 15 cicli per risolubilizzare il pellet proteico prima di quantificare la proteina.
Successivamente, aggiungere 300 microlitri di bicarbonato di ammonio per diluire il campione a una concentrazione finale di 2 Urea molare. Per digerire 50 microgrammi di proteine, aggiungere tripsina e lisina-C ai campioni sul ghiaccio con un rapporto enzima-proteina di 1 a 50.
Mescolare i campioni picchiettando delicatamente e incubarli per una notte a temperatura ambiente per la digestione. Quindi, procedere al protocollo di purificazione dei peptidi.