Procedura di punta A STAGE per la desalinizzazione e la purificazione dei peptidi

Prendi una STop And Go Extraction o STAGE Tip, una colonna di purificazione miniaturizzata.

La punta contiene piccole perle di silice legate a lunghe catene di idrocarburi per la purificazione dei peptidi basata sull'interazione idrofobica.

Lavare con tamponi contenenti un'alta percentuale di acetonitrile, rimuovendo le impurità della resina.

Introdurre un tampone legante e centrifugare, equilibrando la colonna per un legame ottimale dei peptidi.

Caricare un campione di peptidi predigerito ottenuto da cellule differenziate simili a neutrofili, contenente frammenti peptidici e impurità, compresi i sali.

Centrifugare per far passare il campione attraverso la colonna. I frammenti peptidici si legano alle catene idrocarburiche attraverso interazioni idrofobiche, mentre i sali vengono rimossi.

Aggiungere il tampone legante e centrifugare, rimuovendo le impurità rimanenti.

Introdurre il tampone ad alto contenuto di acetonitrile per l'eluizione.

Utilizzando una siringa, far passare il tampone attraverso la colonna. L'acetonitrile si lega alle catene idrocarburiche, sostituendo i frammenti peptidici che eluiscono con il tampone.

Eseguire la profilazione proteomica per identificare i peptidi purificati.

Per iniziare, imballare tre strati di resina C18 in un puntale per pipette da 200 microlitri per costruire un puntale STop And Go Extraction o STAGE per ogni campione di peptide.

Arrestare la digestione enzimatica dei campioni peptidici precedentemente incubati aggiungendo 1 per 10 volumi di soluzione di arresto. Centrifugare i campioni a 13.200 giri/min per 10 minuti e trasferire il surnatante in una nuova provetta da 2 millilitri.

Successivamente, lavare i puntali STAGE con 100 microlitri di acetonitrile al 100% e centrifugare i puntali STAGE a 1000 g per 2 minuti o fino a quando tutto il liquido passa attraverso la resina C18.

Ripetere i lavaggi delle punte STAGE con 50 microlitri di Buffer B seguiti da 200 microlitri di Buffer A con le stesse condizioni di centrifugazione.

Caricare i campioni nelle punte STAGE per centrifugare a 1000 g per 3-5 minuti. Quindi, lavare le punte STAGE con 200 microlitri di Buffer A mediante centrifugazione a 1000 g per 3-5 minuti.

Quindi, aggiungere 50 microlitri di tampone B in ciascun puntale STAGE e, utilizzando una siringa, eluire i campioni contenenti tampone B in una provetta PCR da 0,2 millilitri.

Una volta eluiti i campioni, essiccare i peptidi utilizzando una centrifuga sottovuoto per 45 minuti. Eseguire i campioni con spettrometria di massa ad alta risoluzione con le condizioni descritte nel manoscritto del testo.

Per elaborare i dati per la profilazione proteomica, caricare i file di dati grezzi ottenuti dalla spettrometria di massa nel software MaxQuant. Fare riferimento al manoscritto del testo per tutti i parametri del software e le sue regolazioni.

Nei parametri globali, importare il file FASTA di Homo sapiens per l'identificazione della sequenza scaricato dal database Uniprot registrando l'ID dell'organismo, il numero di proteine e la data di download del file.

Imposta il numero di core del computer per l'elaborazione e seleziona Avvia. Al termine di MaxQuant, viene generata una cartella "Combinata", insieme ad altri file necessari per il caricamento nei repository di dati.

Per analizzare i dati, caricare il 'proteingroups.txt' in Perseus e selezionare tutti i file di quantificazione senza etichetta o di intensità LFQ nella finestra 'Principale'. Filtrare le righe rimuovendo contaminanti, peptidi inversi e peptidi identificati solo per sito e trasformare i dati per log₂(x).

Per osservare il numero di proteine rilevate in ogni replica, costruire un diagramma di Venn numerico e impostare annotazioni categoriali per ogni campione fornendo lo stesso nome per tutte le repliche di un campione biologico.

Filtrare le righe in base al valore valido con la proteina identificata in oltre il 50% delle repliche e all'interno di almeno un gruppo. Per sostituire i valori mancanti per LFQ, eseguire l'imputazione dalla distribuzione normale.

Aggiungi le informazioni di annotazione scaricate dal sito Web di Perseus alle righe delle proteine aggiungendo txt.gz file FASTA nelle cartelle 'bin', 'conf' e 'annotation'. Introduci termini specifici come nomi di proteine, nomi di geni e ontologia genetica.

La matrice è ora completa e può essere visualizzata in strumenti come i grafici di analisi dei componenti principali, le mappe di calore e l'arricchimento delle categorie. Eseguire test statistici per determinare cambiamenti significativi nell'abbondanza di proteine tra le condizioni testate.