Valutazione degli anticorpi neutralizzanti funzionali SARS-CoV-2

Inizia con siero umano diluito in serie contenente concentrazioni variabili di anticorpi neutralizzanti contro la sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 o SARS-CoV-2.

Introdurre virus pseudotipizzati con luciferasi RNA, integrasi e trascrittasi inversa, incapsulati all'interno di un doppio strato lipidico contenente proteine spike di SARS-CoV-2.

Gli anticorpi neutralizzano i virus in base alla diluizione del siero, con diluizioni più basse che mostrano la massima neutralizzazione.

Introdurre cellule bersaglio che esprimono recettori dell'enzima-2 di conversione dell'angiotensina o recettori ACE2 e proteasi transmembrana serina-2 o TMPRSS2.

In diluizioni di siero più elevate, i virus non neutralizzati interagiscono con i recettori ACE2, mentre TMPRSS2 sfalda la proteina spike, consentendo la fusione del virus.

All'ingresso, l'RNA della luciferasi viene trascritto inversamente nel DNA che si integra nel genoma dell'ospite e produce l'enzima luciferasi.

Sostituire il terreno con un tampone di analisi contenente un substrato di luciferasi e un agente lisingante.

Le cellule lisano, rilasciando luciferasi intracellulare, che interagisce con il substrato e produce un'elevata luminescenza.

Quantificare la luminescenza attraverso le diluizioni del siero per determinare la percentuale di neutralizzazione virale: la diluizione che raggiunge la neutralizzazione del cinquanta percento rappresenta il titolo di neutralizzazione.

Per iniziare, aggiungere 50 microlitri di DMEM con il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina alle righe da B a H, colonne da 1 a 12 di una piastra bianca a 96 pozzetti.

Aggiungere 5 microlitri di siero convalescente nei pozzetti della fila A, colonne da 2 a 10, in un volume totale di 100 microlitri di DMEM con il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina. Aggiungere 5 microlitri di antisieri positivi e negativi nei pozzetti A11 e A12 come controlli.

Rimuovere 50 microlitri di soluzione dai pozzetti della fila A ed eseguire due diluizioni seriali di tutti i pozzetti sottostanti. Per ogni diluizione, utilizzare una pipetta multicanale per miscelare le soluzioni 5-10 volte pipettando su e giù senza creare bolle d'aria.

Dopo aver completato la diluizione seriale, scartare gli ultimi 50 microlitri dall'ultimo pozzetto di ogni colonna.

Centrifugare la piastra per 1 minuto a 500 rotazioni al minuto per assicurarsi che non rimanga liquido sulle pareti del pozzetto. Calcolare la quantità di DMEM necessaria per diluire il PV SARS-CoV-2 come descritto nel manoscritto del testo.

Miscelare la soluzione PV diluita in una bacinella per pipette e aliquotare 50 microlitri in ciascun pozzetto, ad eccezione dei pozzetti da A6 a A12 che comprendono il controllo della sola cella. I pozzetti da A1 a A6 fungono da controllo solo fotovoltaico.

Centrifugare la piastra per 1 minuto a 500 rotazioni al minuto per garantire che nessun virus rimanga sulle pareti del pozzetto. Quindi, incubare le piastre a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 1 ora per consentire al siero di legarsi con la glicoproteina SARS-CoV-2.

Successivamente, preparare una piastra di cellule bersaglio HEK 293T/17 trasfettate 24 ore prima con ACE2 e TMPRSS2 plasmidi. Rimuovere il terreno di coltura dalla piastra e lavarla due volte con 2 millilitri di PBS, aggiungendola su un lato della piastra per evitare il distacco delle cellule.

Scartare il PBS e aggiungere 2 millilitri di tripsina alla piastra. Mettere la piastra in un'incubatrice fino a quando le cellule non si sono staccate.

Dopo che le cellule si sono staccate, aggiungere 6 millilitri di DMEM con il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina alla piastra per spegnere l'attività della tripsina e risospendere delicatamente le cellule.

Contare le celle utilizzando un contatore di celle automatizzato o contando il vetrino della camera. Aggiungere 1 x 10⁴ cellule aliquotate in un volume totale di 50 microlitri a ciascun pozzetto e incubare la piastra a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 48-72 ore.

Dopo l'incubazione, rimuovere il terreno di coltura da tutti i pozzetti e aggiungere 25 microlitri di una miscela 1:1 di PBS e un reagente commerciale per il saggio della luciferasi. Leggere la piastra utilizzando un sistema di dosaggio della luciferasi commerciale con un luminometro per micropiastre.

Utilizzando i dati grezzi generati dal luminometro, calcolare i titoli anticorpali neutralizzanti IC50 come descritto nel manoscritto del testo.