Saggi per la valutazione qualitativa e quantitativa delle concentrazioni di glucosio nelle urine di topo

Prelevare una goccia di urina di topo fresca e immergere una striscia per la rilevazione del glucosio contenente glucosio ossidasi, perossidasi e cromogeno.

La glucosio ossidasi ossida il glucosio nelle urine, formando gluconolattone e perossido di idrogeno.

Inoltre, la perossidasi utilizza il perossido di idrogeno per catalizzare l'ossidazione del cromogeno, formando un prodotto colorato, con intensità proporzionale alla concentrazione di glucosio nelle urine.

Confrontare il colore con la tabella di riferimento della striscia per la valutazione qualitativa del glucosio nelle urine.

Per la misurazione quantitativa della glicemia nelle urine, prelevare una piastra a più pozzetti con gli standard di concentrazione del glucosio e il campione di urina di topo raccolto in un periodo definito.

Aggiungere una miscela di test contenente glucosio ossidasi, perossidasi e reagenti di accoppiamento indicatore.

La glucosio ossidasi facilita l'ossidazione del glucosio, formando gluconolattone e perossido di idrogeno. La perossidasi catalizza la reazione tra i reagenti di accoppiamento e il perossido di idrogeno, formando un prodotto di colore rosa.

Utilizzando un lettore di micropiastre, misurare l'assorbanza del prodotto colorato.

Con la curva standard del glucosio generata, determinare la concentrazione di glucosio nelle urine.

Inizia posizionando un pezzo di parafilm pulito su una superficie piana. Prendi delicatamente il mouse per la coda e posizionalo sul parafilm.

Trattieni il mouse per la collottola usando il pollice e l'indice, provocando la minzione del topo come risposta allo stress. Lascia che una goccia di urina cada sulla superficie del parafilm e poi rimetti il topo nella sua gabbia.

Immergere l'estremità del reagente di una striscia per la rilevazione del glucosio nella goccia di urina fresca. Rimuovere immediatamente la striscia e adagiarla su una superficie con il lato del colore rivolto verso l'alto. Quindi, attendi almeno 30 secondi affinché un colore si sviluppi completamente sulla striscia. Confrontare il colore sviluppato con la tabella di riferimento fornita dal produttore.

Assemblare la gabbia metabolica secondo le istruzioni del produttore e riempire il gruppo di alimentazione con cibo in polvere, quindi fissarlo all'apposita linguetta metallica sulla camera superiore.

Fissare il supporto della bottiglia d'acqua alla linguetta metallica rimanente sulla camera superiore. Riempi la bottiglia d'acqua vuota e infilala nel supporto della bottiglia, assicurandoti che il tubo del sorseggiatore sia nel foro.

Metti un solo topo nella gabbia metabolica e coprilo con il coperchio, assicurandoti che il coperchio della gabbia sia montato correttamente. Posizionare la provetta per la raccolta delle urine e la provetta per la raccolta delle feci nei rispettivi punti del pavimento inferiore della camera.

Dopo 24 ore, recuperare la provetta per la raccolta delle urine ed eseguire un test del glucosio per determinare la concentrazione di glucosio nelle urine. Se il dosaggio del glucosio non verrà eseguito lo stesso giorno, congelare il campione di urina in un congelatore a meno 80 gradi Celsius.

Se si utilizza un campione di urina congelato, scongelarlo prima. Preparare otto standard che vanno da 25 a 0 milligrammi per decilitro, secondo le indicazioni del kit di analisi.

Preparare i pozzetti standard e i pozzetti dei campioni di urina in una piastra da 96 pozzetti, tutti in duplicati, secondo il manuale del kit. Avviare la reazione aggiungendo la quantità raccomandata di miscela enzimatica a tutti i pozzetti. Copri la piastra e lasciala incubare per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi, leggere l'assorbanza a 500-520 nanometri utilizzando un lettore di piastre.

Analizzare i dati in base alle istruzioni del kit di analisi e tracciare l'assorbanza di ogni standard rispetto alla concentrazione di glucosio. Utilizza questo grafico per determinare la concentrazione di glucosio del campione di urina delle 24 ore. Se la concentrazione delle urine è al di fuori dell'intervallo standard, diluire il campione di urina.