JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 3:35 min. • July 8th, 2025
Inizia iniettando per via intraperitoneale un glicolipide sintetico in un topo.
Le cellule presentanti l'antigene, o APC, internalizzano il glicolipide e lo presentano attraverso la molecola MHC non classica CD1d.
Le APC migrano verso la milza e interagiscono con le cellule T natural killer invarianti o cellule iNKT, inducendo l'attivazione e la proliferazione delle cellule iNKT.
Raccogli la milza. Dissociarlo meccanicamente per generare una sospensione a cella singola.
Trasferire le cellule in una provetta. Aggiungere un terreno di gradiente di densità e centrifugare per separare i linfociti.
Raccogli i linfociti. Aggiungere tetrameri CD1d marcati con fluorofori caricati con antigene glicolipidico che interagiscono con le cellule iNKT.
Rimuovere i tetrameri non legati. Sovrapposizione con microsfere magnetiche che si legano ai fluorofori legati ai tetrameri.
Rimuovere le perline non legate e caricare la sospensione della cella su una colonna magnetica.
Sotto il campo magnetico, le cellule iNKT legate a perline vengono trattenute nella colonna mentre le celle rimanenti scorrono attraverso.
Rimuovere la colonna dal campo magnetico. Aggiungere un tampone di eluizione per eluire le cellule iNKT.
Iniettare DBA/1 topo normale per via intraperitoneale con alfa-GalCer, alla dose di 0,1 milligrammi per chilogrammo di peso corporeo. Tre giorni dopo la modellazione, dopo l'anestesia, isolare la milza del topo. Preparare una sospensione unicellulare tagliando e macinando la milza in un setaccio da 200 maglie. Lavare la sospensione cellulare con PBS. Centrifugare a 200 volte g per 5 minuti e scartare il surnatante.
Risospendere le cellule con 1 millilitro di sangue intero e soluzione di diluizione tissutale. Aggiungere 3 millilitri di terreno di separazione dei linfociti di topo, quindi centrifugare le cellule per 20 minuti, a 300 volte g, a temperatura ambiente.
Per purificare le cellule iNKT, risospendere da 10 a 7 cellule con 100 microlitri di PBS a 4 gradi Celsius. Aggiungere 10 microlitri di Tetramero-PE CD1d caricato con alfa-GalCer e incubarli a 4 gradi Celsius per 15 minuti al buio. Lavare le cellule due volte con PBS e risospenderle in 80 microlitri di PBS. Aggiungere 20 microlitri di microsfere anti-PE e incubarle a 4 gradi Celsius per 20 minuti al buio. Lavatele due volte con PBS e rimettete in sospensione le cellule con 500 microlitri di PBS.
Posizionare la colonna di cernita nel campo magnetico della selezionatrice MACS e risciacquare con 500 microlitri di PBS. Aggiungere la sospensione cellulare preparata alla colonna di cernita, raccogliere il flusso e risciacquare tre volte con il tampone PBS. Rimuovere il campo magnetico e aggiungere 1 millilitro di tampone PBS alla colonna di smistamento. Spingere rapidamente lo stantuffo a una pressione costante per guidare le cellule marcate nella provetta di raccolta e ottenere le cellule iNKT purificate. Conta con un contatore di celle automatizzato.