JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 2:57 min. • July 8th, 2025
Inizia con una provetta contenente mRNA trascritti in vitro che codificano proteine fluorescenti verdi.
L'mRNA contiene nucleotidi modificati, 5-metil-citidina trifosfato e pseudouridina trifosfato, che prevengono la risposta immunitaria e migliorano la stabilità dell'mRNA.
L'estremità 5' dell'mRNA è defosforilata, impedendone il riconoscimento da parte dei recettori di riconoscimento dei pattern sui macrofagi.
Aggiungere un reagente di trasfezione cationico a base di lipidi all'mRNA, facilitando l'incapsulamento dell'mRNA attraverso interazioni elettrostatiche e formando un complesso.
Introdurre i complessi lipidi-mRNA in una piastra a più pozzetti con macrofagi primari derivati dal topo aderenti e agitare delicatamente per ottenere una miscelazione uniforme.
I macrofagi internalizzano il complesso contenente mRNA in un endosoma. Successivamente, il complesso si fonde con la membrana endosomiale, rilasciando gli mRNA nel citoplasma cellulare.
La coda poli-A all'estremità 3' stabilizza l'mRNA che subisce la sintesi proteica per produrre proteine fluorescenti verdi.
Al microscopio a fluorescenza, la fluorescenza verde all'interno dei macrofagi suggerisce il successo della trasfezion
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