JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 2:57 min. • July 8th, 2025
Inizia con una provetta contenente mRNA trascritti in vitro che codificano proteine fluorescenti verdi.
L'mRNA contiene nucleotidi modificati, 5-metil-citidina trifosfato e pseudouridina trifosfato, che prevengono la risposta immunitaria e migliorano la stabilità dell'mRNA.
L'estremità 5' dell'mRNA è defosforilata, impedendone il riconoscimento da parte dei recettori di riconoscimento dei pattern sui macrofagi.
Aggiungere un reagente di trasfezione cationico a base di lipidi all'mRNA, facilitando l'incapsulamento dell'mRNA attraverso interazioni elettrostatiche e formando un complesso.
Introdurre i complessi lipidi-mRNA in una piastra a più pozzetti con macrofagi primari derivati dal topo aderenti e agitare delicatamente per ottenere una miscelazione uniforme.
I macrofagi internalizzano il complesso contenente mRNA in un endosoma. Successivamente, il complesso si fonde con la membrana endosomiale, rilasciando gli mRNA nel citoplasma cellulare.
La coda poli-A all'estremità 3' stabilizza l'mRNA che subisce la sintesi proteica per produrre proteine fluorescenti verdi.
Al microscopio a fluorescenza, la fluorescenza verde all'interno dei macrofagi suggerisce il successo della trasfezione con mRNA modificati.
Prepararsi per la trasfezione aggiungendo il volume precalcolato del tampone di trasfezione dell'mRNA meno i volumi del reagente di trasfezione dell'mRNA e dell'mRNA a una provetta di reazione. Scongelare il brodo di mRNA e mescolarlo delicatamente capovolgendo il tubo. Quindi, aggiungere il volume precalcolato di mRNA alla provetta di reazione.
Agitare e far girare la miscela di reazione e il reagente di trasfezione dell'mRNA, quindi aggiungere il volume appropriato del reagente di trasfezione dell'mRNA alla provetta della miscela di reazione. Agitare la provetta e farla girare verso il basso, quindi incubarla a temperatura ambiente per 15 minuti. Nel frattempo, sostituire il terreno di coltura dei macrofagi con un terreno di coltura fresco e caldo.
Una volta completata l'incubazione della miscela di trasfezione, aggiungere la miscela ai pozzetti della piastra contenenti i macrofagi goccia a goccia e in un cerchio dall'esterno al centro del pozzetto. Per garantire una distribuzione uniforme della miscela di trasfezione, far oscillare delicatamente la piastra in direzione verticale e orizzontale.
Quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per almeno sei ore. Dopo l'incubazione, analizzare l'efficienza della trasfezione con la microscopia a fluorescenza, la citometria a flusso o l'immunoblot.
La parte più importante di questa procedura consiste nel garantire una distribuzione uniforme della miscela di trasfezione in modo che tutti i macrofagi entrino in contatto con la stessa quantità di mRNA.