JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 5:23 min. • July 8th, 2025
Inizia con le cellule del sangue del cordone ombelicale umano, comprese le cellule staminali ematopoietiche CD34+ o HSC.
Aggiungere anticorpi per bloccare i recettori Fc cellulari, impedendo il legame non specifico delle microsfere magnetiche specifiche per le HSC.
Introdurre le microsfere magnetiche rivestite di anticorpi che hanno come bersaglio le HSC CD34+. Centrifugare e scartare il surnatante.
Risospendere le celle in un buffer. Passarli attraverso un separatore magnetico per trattenere le HSC legate a perline; Le cellule non legate scorrono attraverso.
Rimuovere il campo magnetico per raccogliere le HSC.
Centrifugare e risospendere le cellule in un mezzo di crescita. Placcare le cellule e incubarle.
Il terreno contiene fattori di crescita e citochine che promuovono la sopravvivenza e l'espansione delle HSC.
Raccogli le cellule. Aggiungere un mezzo di congelamento, trasferire in un crioviale e congelare.
Per generare un modello murino del sistema immunitario umano, o HIS, scongelare le HSC. Aggiungerle a un mezzo preriscaldato.
Centrifugare e risospendere le cellule in un tampone.
Le cellule sono pronte per l'iniezione in un cucciolo di topo immunodeficiente per la generazione di modelli HIS.
Per iniziare, risospendere il pellet di cellule CD34-positive isolato dal sangue del cordone ombelicale in 300 microlitri di tampone separatore cellulare magnetico per 1 x 108 cellule. Aggiungere 100 microlitri di reagente bloccante FcR per 1 x 108 cellule, seguiti da 100 microlitri di biglie magnetiche CD34-positive per 1 x 108 cellule, e incubare a 4 gradi Celsius per 30 minuti.
Quindi, aggiungere 5 millilitri di tampone separatore di celle magnetiche per 1 x 108 celle e centrifugare a 360 g per 10 minuti a 4 gradi Celsius. Ripetere la fase di lavaggio e risospendere il pellet in 500 microlitri per 100 milioni di celle di tampone separatore di celle magnetiche in un tubo conico da 15 millilitri etichettato come "non frazionato". Etichettare altre due provette da 15 millilitri: CD34-negativo e CD34-positivo. Posizionare le tre provette su una gratella di raffreddamento.
Separare le cellule utilizzando il programma di selezione positiva a due colonne su un separatore automatico di celle magnetiche in una cabina di biosicurezza. Successivamente, per espandere e congelare le cellule staminali umane CD34-positive, preparare il sangue del cordone ombelicale o il terreno CB come descritto nel manoscritto e passare attraverso un filtro da 0,22 micron. Risospendere le cellule CD34-positive a 100.000 per millilitro di terreno CB e incubare a 37 gradi Celsius.
Il terzo giorno, aggiungere un volume uguale di terreno CB senza citochine al pallone. Il quinto giorno, raccogli le cellule CD34-positive espanse. Pipettare la sospensione cellulare su e giù e raccoglierla in una provetta conica da 50 millilitri. Aggiungere una quantità di CB sufficiente a coprire il fondo del pallone. Usando un raschietto per cellule, raschiare l'intero fondo del pallone. Raccogliere tutti i terreni nella stessa provetta da 50 millilitri e centrifugare.
Risospendere le cellule in 2 millilitri di terreno CB e centrifugare. Aspirare il fluido fino al pellet e risospendere il pellet in un mezzo di congelamento. Successivamente, iniziare la preparazione delle cellule CD34-positive tre ore dopo l'irradiazione del cucciolo. Scaldare 10 millilitri di terreno CB in un tubo da 50 millilitri.
Recuperare una fiala di cellule CD34-positive espanse e congelate in vitro ogni quattro o sei cuccioli da iniettare. Scongelare rapidamente a 50-55 gradi Celsius, fino a quando non è visibile solo una piccola quantità di ghiaccio, e aggiungere le celle al mezzo CB riscaldato. Utilizzare 1 millilitro di terreno per sciacquare ogni fiala e centrifugare le cellule a 360 g per 12 minuti a 4 gradi Celsius.
Aspirare il terreno con cura. Risospendere il pellet in 2 millilitri di terreno CB e contare le cellule. Anche in questo caso, centrifugare le cellule, aspirare il terreno e risospendere il pellet in 100 microlitri di PBS sterile per n più 1 cucciolo da iniettare, ottenendo da 250.000 a 450.000 cellule CD34-positive per topo.