JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 visualizzazioni • 3:44 min • July 8th, 2025
Prendi due cuvette per elettroporazione. Una cuvetta contiene un piccolo RNA interferente, o siRNA, progettato per inibire la produzione di FIP200, una proteina che induce l'autofagia.
La seconda cuvetta contiene un siRNA criptato come controllo che non inibisce la produzione di FIP200.
Aggiungere cellule dendritiche immature, o iDC, elettroporare per l'ingresso cellulare di siRNA e quindi placcare le cellule.
Il siRNA internalizzato si lega a un complesso di silenziamento che induce l'RNA.
Il complesso con il siRNA specifico per FIP200 scinde il suo mRNA bersaglio, inibendo la produzione di FIP200, mentre le iDC trattate con siRNA di controllo producono FIP200.
Raccogli le cellule e aggiungi il virus dell'herpes simplex. Dopo la fusione virale della membrana dell'involucro cellulare, il DNA rilasciato entra nel nucleo e porta alla produzione di proteine virali e nucleocapsidi.
Le proteine virali distruggono le lamine nucleari. FIP200 forma un complesso che innesca una cascata di segnalazione, inducendo l'autofagia delle lamine interrotte per bersagliarle per la degradazione e facilitando la fuga dei nucleocapsidi virali nel citoplasma.
L'inibizione mediata da siRNA della produzione di FIP200 limita l'autofagia della lamina, impedendo la fuga del nucleocapside.
Le cellule sono pronte a valutare l'inibizione dell'autofagia indotta da siRNA.
Il giorno 3,5 dopo l'aderenza, trasferire 12 milioni di iDC in una provetta da 50 millilitri. Centrifugarli a 300 volte g per 5 minuti, quindi scartare il surnatante. Parallelamente, eseguire l'analisi citofluorimetrica per monitorare lo stato di maturazione.
Lavare delicatamente gli iDC in 5 millilitri di OptiMEM senza rosso fenolo e centrifugarli a 300 volte g per 5 minuti. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 200 microlitri di OptiMEM, regolando la concentrazione cellulare a 6 milioni di cellule per 100 microlitri.
Aggiungere 75 picamoli di siRNA specifico per FIP200 o criptato a cuvette di elettrodi da 4 millimetri e trasferire 100 microlitri della sospensione cellulare nella rispettiva cuvetta. Pulsare direttamente gli iDC utilizzando un apparecchio di elettroporazione.
Dopo l'elettroporazione, trasferire gli iDC in piastre a sei pozzetti con terreno DC fresco preriscaldato, seminando le cellule a una concentrazione finale di 1 milione di cellule per millilitro, e metterle nell'incubatore. Dopo 48 ore, esaminare al microscopio la morfologia delle iDC elettroporate, quindi raccogliere le cellule con un raschietto cellulare e trasferirle in provette da 15 millilitri.
Sciacquare i pozzetti con 1 millilitro di PBS integrato con EDTA allo 0,01% e trasferire la soluzione nelle rispettive provette. Quindi, dividere le cellule per ogni condizione di siRNA come descritto nel manoscritto.
Utilizzare 500.000 cellule per valutare lo stato di maturazione e la vitalità cellulare. Utilizzare 1 milione di cellule per l'analisi del western blot per verificare l'efficienza di knockdown specifica di 200 e utilizzare le cellule rimanenti per esperimenti di infezione da HSV-1.