JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 visualizzazioni • 3:52 min • July 8th, 2025
Prendiamo le cellule T regolatorie derivate da iPSC, o Treg, che esprimono recettori specifici per l'ovoalbumina. Iniettali nella vena caudale di un topo trattenuto.
Le cellule raggiungono la membrana sinoviale che riveste la superficie interna della capsula articolare del ginocchio.
Successivamente, somministrare albumina sierica bovina metilata o mBSA, emulsionata con un adiuvante.
Gli adiuvanti migliorano la presentazione di mBSA alle cellule presentanti l'antigene, o APC, che elaborano e presentano i frammenti tramite molecole MHC.
Le APC migrano verso i linfonodi, inducendo l'attivazione delle cellule T. Le cellule T attivate migrano verso l'articolazione del ginocchio.
Iniettare mBSA da solo e mBSA con ovoalbumina rispettivamente nelle articolazioni del ginocchio sinistro e destro.
Nel ginocchio sinistro, le APC presentano i frammenti mBSA alle cellule T attivate, innescando il rilascio di citochine pro-infiammatorie e portando a danni tissutali e gonfiore articolare, chiamato artrite.
Nel ginocchio destro, le Treg interagiscono con le APC che presentano l'ovoalbumina e rilasciano citochine antinfiammatorie, riducendo il danno tissutale e il gonfiore articolare, migliorando così l'artrite.
Inizia staccando le colture cellulari di interesse con la tripsina e risospendendo ogni tipo di cellula in 10 millilitri di terreno fresco. Placcare ogni coltura cellulare in un nuovo piatto da 10 centimetri e lasciare che le cellule di alimentazione aderiscano nell'incubatore per colture cellulari. Dopo 30 minuti, raccogliere le iPSC galleggianti e passare le colture attraverso singoli filtri cellulari da 70 micron per rimuovere i cluster cellulari per il conteggio.
Risospendere ciascuna coltura a una concentrazione di 1,5 x 107 cellule per millilitro in PBS freddo, filtrando nuovamente se necessario. Quindi, posizionare i topi femmina C57BL6 di 4-6 settimane uno alla volta in un piccolo sistema di contenzione per animali e trasferire adottivamente 200 microlitri di un tipo di cellula per topo nella vena caudale di ciascun animale.
Utilizzare un calibro a quadrante per misurare il gonfiore di entrambe le ginocchia per stabilire la misurazione di base. 10 giorni dopo il trasferimento cellulare, utilizzare una siringa da 1 millilitro per iniettare nei topi 100 microgrammi di BSA metilato emulsionato in adiuvante di Freund completo alla base della coda di ciascun animale da esperimento.
17 giorni dopo il trasferimento cellulare, indurre l'artrite mediante iniezione intra-articolare di 20 microgrammi di BSA metilato in 10 microlitri di PBS nell'articolazione del ginocchio sinistro e 20 microgrammi di BSA metilato e 100 microgrammi di ovoalbumina intera in 10 microlitri di PBS nell'articolazione del ginocchio destro di ciascun animale anestetizzato trasferito in modo adottivo.
Sette giorni dopo aver indotto l'artrite, misurare nuovamente le ginocchia per calcolare l'aumento percentuale del diametro del ginocchio e asportare chirurgicamente le rotule. Fissare le articolazioni in formalina. Quindi, dopo la decalcificazione in EDTA, incorporare le ginocchia nella paraffina e ottenere sezioni da 4 micron per la colorazione e l'analisi istochimica.