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Immunologia
0 visualizzazioni • 4:42 min • July 8th, 2025
Prendiamo i vettori retrovirali mescolati con le cellule primarie della milza.
I vettori contengono RNA transgenico che codifica per un recettore chimerico dell'antigene o CAR, che prende di mira un antigene specifico del tumore.
La citochina interleuchina-2 nel terreno promuove selettivamente la proliferazione delle cellule T mentre le altre cellule alla fine muoiono.
Trasferire la miscela in una micropiastra rivestita con frammenti di fibronectina ricombinante.
Centrifugare per facilitare i frammenti di fibronectina che legano i vettori e le cellule T, mediando l'interazione virus-cellula ospite, e incubare.
Dopo la fusione dell'involucro dei vettori con la membrana cellulare, gli enzimi virali trascrivono l'RNA rilasciato in DNA e lo incorporano nel genoma ospite.
Le cellule T trasdotte esprimono CAR legate alla superficie, costituite da un frammento variabile di anticorpo extracellulare che ha come bersaglio l'antigene specifico del tumore e le regioni di segnalazione intracellulare per rispondere all'antigene.
Risospendere le cellule prima di trasferirle in una provetta.
Centrifugare per scartare il surnatante contenente virus non internalizzati e risospendere le cellule in un tampone per i saggi a valle.
Il giorno dopo la splenectomia, preparare PBS contenente 25 microgrammi per millilitro di frammento di fibronectina umana ricombinante o RHFF e rivestire le piastre a 24 pozzetti trattate con coltura non tissutale aggiungendo 0,5 millilitri della soluzione a ciascun pozzetto. Il giorno seguente, rimuovere la soluzione dai pozzetti e aggiungere 1 millilitro per pozzetto di BSA al 2% in PBS.
Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti, quindi rimuovere il BSA capovolgendo saldamente la piastra prima di aggiungere 2 millilitri di PBS per il lavaggio. Dopo aver raccolto il surnatante virale dalle cellule HEK293T, aggiungere TCM fresco a un volume finale in millilitri pari al numero di pozzetti rivestiti di RHFF più altri 3 millilitri.
Rimuovere gli splenociti in coltura dall'incubatore e risospendere pipettandoli delicatamente su e giù due o tre volte in ciascun pozzetto. Trasferire le sospensioni cellulari in un tubo conico da 50 millilitri. Successivamente, risospendere gli splenociti nel surnatante virale a 1 x 106 cellule per millilitro.
Quindi, aggiungere 1 millilitro per pozzetto della sospensione di splenociti ai pozzetti delle piastre rivestite di RHFF. Ora, centrifugare le piastre per 90 minuti a 32 gradi Celsius e 770 gs con un'accelerazione di 4 e un'impostazione di pausa pari a zero. Durante la centrifuga, preparare 50 unità internazionali per millilitro di IL-2 umana ricombinante in MTC.
Dopo la centrifuga, aggiungere 1 millilitro di terreno a ciascun pozzetto delle piastre e incubare per una notte. Se le cellule T raggiungono una confluenza superiore all'80%, dividere le cellule pipettando delicatamente su e giù in ciascun pozzetto, due o tre volte, quindi trasferire 1 millilitro da ciascun pozzetto in nuovi pozzetti di una piastra fresca trattata con coltura tissutale a 24 pozzetti.
Aggiungere 1 millilitro di MTC fresco, con 50 unità internazionali per millilitro di IL-2 in ogni pozzetto. Se le cellule non raggiungono una confluenza superiore all'80%, sostituire metà del terreno pipettando lentamente 1 millilitro di terreno dalla parte superiore di ciascun pozzetto e sostituendolo con 1 millilitro di MTC fresco, contenente 50 unità internazionali per millilitro di IL-2 umana ricombinante.
Risospendere le cellule CAR T pipettandole delicatamente su e giù tre volte in ciascun pozzetto e trasferirle in una provetta da centrifuga da 250 millilitri. Centrifugare le celle a 300 gs per 10 minuti. Quindi aspirare completamente il surnatante senza disturbare il pellet. Utilizzare il PBS per lavare le cellule, quindi contarle prima di lavarle una seconda volta. Una resa tipica delle cellule T CAR è di circa 1 x 106 cellule per pozzetto.