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Immunologia
0 visualizzazioni • 2:30 min • July 8th, 2025
Prendiamo le cellule T sospese in un mezzo adatto all'elettroporazione, un processo in cui gli impulsi elettrici creano pori temporanei nella membrana cellulare.
Aggiungi complessi contenenti una proteina Cas9 e un singolo RNA guida o sgRNA. sgRNA è un piccolo RNA che dirige Cas9, una forbice molecolare, in una posizione specifica sul DNA per il taglio.
Aggiungere brevi molecole di DNA a filamento singolo che aiutano a trasportare i complessi Cas9-sgRNA nella cellula.
Trasferire questa miscela in una cuvetta e avviare l'elettroporazione applicando brevi impulsi elettrici.
Questo processo consente ai complessi di entrare nella cellula.
L'sgRNA si lega al sito bersaglio nel DNA delle cellule T, consentendo a Cas9 di modificare il DNA, creando una rottura in entrambi i filamenti.
Questa interruzione segnala le proteine di riparazione al sito.
Le proteine di riparazione quindi ricollegano le estremità, rendendo il gene non funzionale.
Incubare le cellule T geneticamente modificate in un terreno adatto per i saggi a valle.
Preparare la ribonucleoproteina, o complesso RNP, incubando 10 microgrammi di nucleasi Cas9 con 5 microgrammi di RNA guida singolo per 10 minuti a temperatura ambiente. Includere un controllo simulato senza RNA guida singolo. Combina le cellule T risospese con il complesso RNP e aggiungi 4,2 microlitri di potenziatore dell'elettroporazione a 4 micromolari. Mescolare bene e trasferire in cuvette per elettroporazione.
Galvanizzare le celle utilizzando il codice a impulsi EH-1-11. Quindi, incubare 5 milioni di cellule per millilitro in R-10, integrato con cinque nanogrammi per millilitro di IL-7 umano e Il-15 umano a 30 gradi Celsius per 48 ore in piastre a 12 pozzetti. Dopo l'incubazione, procedere con l'attivazione e l'espansione delle cellule T.