Una tecnica CRISPR-Cas9 per l'editing genetico nelle cellule T

Prendiamo le cellule T sospese in un mezzo adatto all'elettroporazione, un processo in cui gli impulsi elettrici creano pori temporanei nella membrana cellulare.

Aggiungi complessi contenenti una proteina Cas9 e un singolo RNA guida o sgRNA. sgRNA è un piccolo RNA che dirige Cas9, una forbice molecolare, in una posizione specifica sul DNA per il taglio.

Aggiungere brevi molecole di DNA a filamento singolo che aiutano a trasportare i complessi Cas9-sgRNA nella cellula.

Trasferire questa miscela in una cuvetta e avviare l'elettroporazione applicando brevi impulsi elettrici.

Questo processo consente ai complessi di entrare nella cellula.

L'sgRNA si lega al sito bersaglio nel DNA delle cellule T, consentendo a Cas9 di modificare il DNA, creando una rottura in entrambi i filamenti.

Questa interruzione segnala le proteine di riparazione al sito.

Le proteine di riparazione quindi ricollegano le estremità, rendendo il gene non funzionale.

Incubare le cellule T geneticamente modificate in un terreno adatto per i saggi a valle.

Preparare la ribonucleoproteina, o complesso RNP, incubando 10 microgrammi di nucleasi Cas9 con 5 microgrammi di RNA guida singolo per 10 minuti a temperatura ambient