Generazione di un modello murino BLT (midollo osseo, fegato, timo) doppiamente umanizzato

Inizia con un topo anestetizzato e immunodeficiente che manca di cellule immunitarie.

Trattare il topo con una dose sub-letale di raggi X per eliminare le cellule staminali esistenti dal midollo osseo.

Sezionare il topo e rilasciare frammenti di fegato fetale umano e tessuto del timo tra il rene e la sua capsula.

Chiudere l'incisione.

Il fegato impiantato e il tessuto del timo crescono, formando organoidi, che sono aggregati cellulari simili a un organo.

Dopo il recupero, iniettare cellule staminali ematopoietiche umane o HSC nella vena caudale.

Le HSC iniettate migrano verso l'organoide del timo e il midollo osseo, differenziandosi in varie cellule immunitarie umane.

Fornire acqua integrata con antibiotici al topo per uccidere i microbi intestinali esistenti.

Utilizzando un tubo orale, introdurre microbi fecali umani direttamente nell'intestino del topo per promuovere la colonizzazione microbica.

Ciò si traduce nello sviluppo di un modello di topo BLT doppiamente umanizzato con un sistema immunitario umano e microbi intestinali.

Per impiantare i tessuti del fegato e del timo nella capsula renale sinistra, in primo luogo, posizionare il topo in un cappuccio. Il giorno dell'intervento, trattare i topi con irradiazione subletale di tutto il corpo a una dose di 12 centi-gray per grammo di peso corporeo. Radere ogni topo intorno al lato laterale sinistro e mediale dopo aver confermato un livello appropriato di sedazione. Applicare un unguento oftalmico sugli occhi dell'animale e applicare un marchio auricolare secondo necessità e disinfettare la pelle con tre scrub sequenziali allo iodio e isopropanolo al 70%.

Quando la pelle è stata preparata, utilizzare una pinza per caricare un frammento di tessuto epatico fetale umano cubizzato da 1 a 1,6 millimetri in un trocar, seguito da un frammento di tessuto fetale fetale umano da 1 a 1,6 millimetri cubi. Usa le pinze per sollevare la pelle e usa un bisturi per fare un piccolo taglio longitudinale nella pelle. Estendi il taglio da 1,5 a 2 centimetri sul lato sinistro del mouse e usa una pinza per sollevare lo strato muscolare. Usa le forbici per aprire longitudinalmente lo strato muscolare, estendendo il taglio se necessario, per esporre il rene e afferrare delicatamente il tessuto adiposo che circonda il rene.

Utilizzare un bisturi per praticare un'incisione da 1 a 2 millimetri all'estremità posteriore della capsula renale e inserire lentamente il trocar precaricato nell'incisione, parallelamente all'asse lungo del rene. Rilascia i tessuti tra la capsula renale e il rene e riporta il rene e l'intestino nelle loro posizioni normali. Quindi, usa le suture per chiudere lo strato muscolare e le graffette chirurgiche per chiudere la pelle. Posizionare il topo in una gabbia microisolatore autoclavata con monitoraggio fino alla completa decubito. Sei ore dopo l'intervento, metti i topi sotto una lampada riscaldante e disinfetta i racconti con isopropanolo al 70%.

Iniettare da 1,5 a 5 x 10⁵ cellule staminali ematopoietiche isolate di tessuto epatico fetale umano CD34-positivo in 200 microlitri di PBS in una vena caudale dilatata per animale. Quindi, ferma qualsiasi emorragia con una leggera pressione e riporta i topi nella loro gabbia di casa. Da 9 a 12 settimane dopo l'intervento, utilizzare un cono di plastica di dimensioni adeguate per isolare una zampa di un topo umanizzato e spruzzare il lato mediale della gamba isolata con isopropanolo al 70%. Stendere antibiotico e unguento antidolorifico sul sito di raccolta.

Utilizzando un ago calibro 25 tenuto a un angolo di 90 gradi, perforare la vena safena per raccogliere da 50 a 100 microlitri di sangue in una provetta per la raccolta del sangue rivestita di EDTA. Quando è stato ottenuto un volume adeguato di sangue, applicare pressione sul sito con il pezzo di garza sterile per fermare l'emorragia prima di rimettere il topo nella sua gabbia. Quindi, utilizzare il campione di sangue periferico raccolto per valutare il livello di ricostituzione delle cellule immunitarie umane mediante citometria a flusso, utilizzando anticorpi contro CD45, CD3, CD4, CD8, CD19 e CD45 di topo.

Per la raccolta di campioni fecali freschi, posizionare i singoli sacchetti di carta autoclavati in una cappa aspirante e posizionare un topo in ogni sacchetto fino a quando ogni animale non defeca. Quindi, rimetti i topi nella loro gabbia e usa una pinza sterile per trasferire ogni campione fecale in una provetta da 1,5 millilitri per topo per una conservazione a meno 80 gradi Celsius.

Al termine del trattamento antibiotico di 14 giorni, cambiare l'acqua potabile con acqua sterilizzata in autoclave e trasferire i topi in una nuova gabbia sterilizzata in autoclave. 24 e 48 ore dopo la cessazione degli antibiotici, riempire le fonti adeguatamente preparate di materiale per il trapianto di microbiota fecale e aliquotare i campioni in una camera anaerobica in condizioni anaerobiche.

Per eseguire un trapianto fecale, somministrare 200 microlitri di materiale per il trapianto di microbiota fecale tramite sonda orale a ciascun animale da esperimento e spargere il materiale scongelato rimanente sulla pelliccia dei topi umanizzati o sulla lettiera della gabbia.