Una terapia fagica contro l'infezione da Pseudomonas aeruginosa negli embrioni di zebrafish

Prendi embrioni di zebrafish di fibrosi cistica dechorionata anestetizzati suscettibili all'infezione da Pseudomonas aeruginosa.

Iniettare Pseudomonas aeruginosa che esprime la proteina fluorescente in un vaso sanguigno principale, il dotto di Cuvier.

Trasferire gli embrioni iniettati su una piastra con terreno e un agente bloccante della pigmentazione per inibire la pigmentazione e visualizzare i batteri. Incubare.

I batteri iniettati si muovono attraverso la circolazione e invadono gli organi.

In risposta, il sistema immunitario dell'ospite si attiva, rilasciando mediatori pro-infiammatori e reclutando cellule immunitarie.

Dopo l'incubazione, iniettare un cocktail di fagi virulenti contro Pseudomonas aeruginosa nel dotto di Cuvier e trasferire gli embrioni in una piastra contenente terreno e l'agente bloccante la pigmentazione.

incubare. I fagi infettano i batteri e utilizzano il macchinario ospite per produrre nuove particelle di fagi.

I batteri lisi, rilasciando fagi che infettano i batteri vicini, con conseguente riduzione della risposta pro-infiammatoria.

Utilizzando un microscopio a fluorescenza, osservare la ridotta fluorescenza batterica negli embrioni di zebrafish nel tempo, indicando l'efficacia dei fagi contro Pseudomonas aeruginosa.

A 26 ore dalla fecondazione, caricare un ago per microiniezione con circa 5 microlitri di inoculo di P. aeruginosa e inserire l'ago dorsalmente fino al punto iniziale del dotto di Cuvier, dove il dotto inizia a diffondersi sul sacco vitellino. Iniettare da 1 a 3 nanolitri di inoculo PAO1 nell'embrione, assicurandosi che il volume si espanda direttamente all'interno del dotto ed entri in circolo.

Dopo l'iniezione, trasferire l'embrione in una delle due nuove piastre di Petri contenenti terreno E3 fresco integrato con feniltiourea per un'incubazione di 30 minuti o 3 ore a 28 gradi Celsius. Quindi, caricare un ago per microiniezione con circa 5 microlitri di cocktail di fagi e fissare l'ago al microiniettore. Quindi, iniettare da 1 a 3 nanolitri di cocktail di fagi nel dotto di Cuvier di ogni embrione precedentemente iniettato con batteri e posizionare gli embrioni in una delle due nuove piastre di Petri contenenti terreno E3 fresco integrato con feniltiourea a 28 gradi Celsius.