JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 2:43 min. • July 8th, 2025
Inizia con una soluzione polimerica congelata contenente polimeri caricati positivamente.
Scongelare la soluzione polimerica fino a raggiungere la temperatura ambiente.
Aggiungere un tampone e un vortice per una miscelazione uniforme, generando una soluzione omogenea.
Introdurre l'mRNA bersaglio nella soluzione polimerica in un rapporto uguale per una reazione ottimale.
Incubare per consentire ai polimeri caricati positivamente di interagire con i gruppi fosfato caricati negativamente nell'mRNA tramite interazioni elettrostatiche.
Ciò facilita l'incorporazione dell'mRNA all'interno della struttura polimerica, formando nanoparticelle di complessi mRNA-polimero o poliplex.
Trasferire questi poliplex in una provetta contenente acqua priva di RNasi.
Mescolarli e lasciare precipitare i poliplex.
Introdurre un tampone contenente saccarosio e congelarlo. Il saccarosio agisce come crioprotettore che mantiene l'integrità strutturale dei poliplex.
Quindi, eseguire la liofilizzazione, per rimuovere eventuali tracce di acqua.
Conservalo a bassa temperatura come candidato vaccino a mRNA per un uso futuro.
Per la formazione di poliplessi, scongelare i polimeri precedentemente preparati peptidi C-6 poli-beta amminoesteri e agitare la soluzione. Dopo aver pipettato la miscela di polimeri su e giù, preparare una soluzione da 12,5 millimolari in acetato di sodio. Agitare la soluzione e attendere 10 minuti.
Successivamente, preparare l'mRNA a 0,5 milligrammi per millilitro e mescolare mediante pipettaggio. Agitare nuovamente la soluzione polimerica. Quindi, mescolare la soluzione di materiale genetico nella soluzione polimerica in un rapporto uno a uno in una provetta da microcentrifuga e incubare la provetta a 25 gradi Celsius per 30 minuti in un blocco termico. Dopo l'incubazione, precipitare la miscela con una o due acque prive di RNasi aggiungendo il campione a una provetta da microcentrifuga contenente l'acqua.
Quindi, per includere gli eccipienti, aggiungere HEPES 20 millimolari e una soluzione di saccarosio al 4% nello stesso volume della miscela di mRNA e poli-beta esteri amminici e mescolare mediante pipettaggio. Per la liofilizzazione, dopo aver congelato la soluzione di polyplex a meno 80 gradi Celsius per un'ora, eseguire l'essiccazione primaria, quindi conservare immediatamente i polyplex a meno 20 gradi Celsius per evitare la reidratazione.